实验二 双水相萃取分离糖化酶.ppt

双水相体系就是考虑到这种现状，基于液液萃取理论同时考虑保持生物活性所开发的一种新型的液液萃取分离技术。 双水相萃取技术的优点： 作为一种新型的分离技术，克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用，提供了一个温和的活性环境，在萃取过程中具有保持生物物质的活性及构象等明显的技术优势。 双水相萃取技术缺点： 易乳化、相分离时间长，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物大多数黏度较大，不易定量控制；水溶性的高聚物难以挥发，使反萃必不可少，高聚物回收困难等。 2 双水相体系 2.1 双水相的形成机理 2.1.1 概念 某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多相水相体系，两相中水的含量都很高，如下图：由聚乙二醇6000与葡聚糖两种混合物形成的双水相体系示意图： 2 双水相体系 2.2 相图 2.2 相图 2.3 常用的双水相体系 常用体系 双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dex，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dex。 3 双水相萃取原理 3.1 双水相萃取的基本原理 双水相萃般与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。 当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。 其分配规律服从Nernst分配定律 CT、CB分别代表上相、下相中的溶质的浓度。研究表明，在相体系固定时，预分离物质在相当大的浓度范围内，分配系数K为常数，与溶质的浓度无关，只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系。 3.2 影响物质分配平衡的因素 影响物质在双水相系统巾分配的 主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型； 高聚物的平均分子量和分子量分布； 高聚物的浓度； 成相盐和非成相盐的种类；盐的离子强度；pH值。 (1)高聚物的分子量 在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的分子量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，将更多的分配于该相。对PEG – Dcxtran体系而言，Dextran分子量减小，分配系数会减小； PEG 的分于量减小，物质的分配系数会增大(见表2-13)，这是一条普遍规律。 (2)高聚物浓度—界面张力的影响 当成相系统的总浓度增大时，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增大，蛋白质越容易分配到其中的一相。 (3)盐类 由于盐的正、负离子在两相间的分配系数不同，两相间形成电势差，从而影响带电生物大分子的分配。如下图：加入氯化钠对卵蛋白和溶菌酶分配系数的影响 研究还发现，当盐类浓度增加到一定程度，由于盐析作用蛋白质易分配于上相。分配系数几乎随盐浓度成指数增加，且不同的蛋白质增大程度各异。利用此性质可使蛋白质相互分离。KCl对分配的影响与NacI类似。 (4)pH值 pH值对分配的影响源于两个方面的原因。 第一，pH值会影响蛋白质分子所带电荷的性质和数量。 第二，pH值影响磷酸盐的离解程度，从而改变H2PO4-和HPO42- 之间的比例，进而影响相间电位差。这样蛋白质的分配因pH值的变化发生变化。pH值的微小变化会使蛋白质的分配系数政变2～3个数量级。 (5)温度 温度影响双水相系统的相图，从而影响蛋白质的分配系数。温度越高发生相分离所需的高聚物浓度越高。在临界点附近对双水相体系形成的影响更为明显。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，1～2℃的温度改变不影响目标产物的萃取分离。 由于高聚物对生物活性物质有稳定作用，在大规模生产中多采用常温操作，从而节省冷冻费用。但适当提高操作温度，体系黏度较低，有利于分离。 3.3 双水相萃取过程 双水相萃取过程包括以下几个步骤： 双水相的形成； 溶质在双水相中的分配； 双水相的分离。 3.3 双水相萃取过程 在实际操作中，经常将固状(或浓缩的)聚合物和盐直接加入到细胞匀浆液中，同时进行机械搅拌使成相物质溶解，形成双水相。 溶质在两相中发生物质传递，达到分配平衡。 聚合物和盐的溶解多为萃取过程的速率控制步骤。达到分配平衡后的两相分离可采用重力沉降(静置分层)或离心沉降法。 3.4 双水相萃取的特点 双水相萃取对于生物物质的分离和纯化表现出特有的优点和独有的技术优势，具体表现在以下方面