组织培养技术3.ppt

组织培养技术 细胞培养中的细胞工程技术 细胞工程 cell engeneering 按人们的意愿用细胞学或分子生物学技术改变细胞性状，使之成为能满足某种研究需要的方法。 它是一种建立在细胞生物学理论和应用现代新技术基础上所形成的技术科学。 一、细胞转化技术 细胞转化与恶变 自发转化 在未用任何诱变剂处理的情况下，细胞自发出现转化现象。 表现为：核型异倍化、获得永生性、接触抑制消失 诱发转化 化学、物理和生物等各种致癌因素，都可人为地诱发细胞发生转化。从细胞受到打击后到发生恶性转化，一般需两周到三个月的时间。 细胞转化基本过程 诱发 致突变或诱发DNA损伤的过程。 处于DNA合成阶段的细胞易受致癌物损伤。 DNA的损伤与修复 当DNA损伤后并发生错误性修复，且这种变化被固定下来，也即形成不可逆的结局时，标志着DNA发生遗传性改变。 发展 细胞DNA受损和被固定后，通过细胞的反复增殖，使损伤进一步得到发展和表现。 诱发因素诱发细胞转化程序 细胞选择 原代细胞 二倍体成纤维细胞、人胚胎成纤维细胞 转化细胞 C3H、3T3、BALB/3T3、NIH/3T3鼠胎细胞， BHK21(鼠肾) Rat-1（大鼠细胞） PC-12 肾上腺嗜铬细胞瘤 诱发培养细胞的转化 转化因素 改变DNA结构的因素。化学、物理、病毒、癌基因 转化灶的分离 刮除法和消化法 转化细胞的检测 形态生长性状、核型畸变等遗传性状、恶性试验（浸润性、软琼脂培养、异体动物接种、凝集试验） 几种常用的细胞转化技术 化学致癌物转化细胞 胚胎鼠（叙利亚地鼠），致癌物（MNNG） 病毒转化细胞 EBV转化人淋巴细胞（微量全血法） 癌基因转化细胞 细胞转化是检测癌基因性状的重要手段。 二倍体细胞较难转化，永生性细胞比二倍体细胞易于转化，是常用的对象，尤适合检测ras家族癌基因。 二、细胞融合技术 定义： 两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程。 原理 人工诱导物如仙台病毒、聚乙二醇(PEG)作用下两个以上细胞膜发生融合成新杂种细胞 hybrid 。 首先是细胞质的融合，然后通过有丝分裂细胞核合而为一，形成新细胞。 融合方法 融合剂PEG(1000-6000) 易得，用法简单，效果稳定 杂交瘤细胞筛选 三、培养细胞的脱核法 过程： 分离核，形成无核胞质体或无胞质的核质体。常用松胞菌素B处理，高速离心脱核。 方法： 将塑料园板放入离心管内，加细胞悬液，在CO2温箱培养，将园板移入另一离心管内，加营养液，离心，洗涤，继续培养。 四、细胞同步化法 原理 人为方法使细胞共同进入细胞周期同一阶段。当温度降低时细胞DNA的合成停止，细胞阻滞于G1期，37度时多是细胞同步，进入合成期，随之出现分裂期。 方法 低温处理法：指数生长期细胞4度2-10小时，再37度6-12小时，吸出营养液，冲下变圆细胞加入另一瓶培养，80%同步生长。 秋水仙素阻抑法：利用秋水仙阻抑法使细胞至分裂中期，分离细胞，接种于培养瓶内，继续培养，细胞同步进入增埴周期 细胞培养中的基因转导技术 一、基因转导技术的原理 基因转导： 把基因导入细胞中的技术 把基因导入细胞内使外源基因能整合入受体细胞基因组中； 是研究基因表达、结构和功能的技术方法，基因导入已成为基因研究的重要手段。培养细胞是最适宜的对象。基因转导，尤其对于检测癌基因，更为常用。 基因细胞内转导技术方法 基因转导方法和受体细胞的选择 基因导入后的表达与受体细胞性状、细胞种类、来源有密切关系。选择合适的受体细胞。 方法选择： 若想获取瞬时表达效果（转染后1-4天内即可收集细胞，进行对被转染的基因检测），所有方法都可用。 磷酸钙法、电击法、脂质体介导法有稳定转染效应，是用于稳定表达。 电击法：易实行，重复性好 磷酸钙法和脂质体介导法：适用于贴附生长细胞的转化。须优化实验条件。 基因转导在癌基因研究中的应用 癌基因存在于人或动物细胞中，癌基因的定性、定位、克隆和表达等，都离不开细胞培养技术。 癌基因和抑癌基因本质上都是一些参与调控细胞增殖和分化有关的基因。他们的异常表达与细胞恶性转化和癌变有关。 癌基因的表达也可利用培养细胞进行检测，因此细胞培养已成为研究基因、癌基因和抑癌基因表达的重要手段，成为分子生物学的组成部分。 二、基因转导的常用方法 微小细胞融合介导法： 能转移完整染色体，但程序较复杂 磷酸钙法： 操作简便，转染率较低； 逆转录病毒感染技术： 转染效率高并可将单拷贝基因转录入细胞中，缺点是导入的基因片段较小，容易出现假阳性，并注意操作过程中的安全防护 微小细胞融合介导基因转导（染色体转导） 原理 由于用常规方法制备的高分子量DNA片段一般在50-80kb，因此所用DNA片段长度受到限制。