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和元无缝组装试剂盒说明书 Catalog NO. OBCR （A ）-20/50 产品规格： 20 次反应、50 次反应 试剂保存：-20℃保存 和元无缝组装试剂盒是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有专门针对多片段重组反应而优化的反应缓冲液和重组酶。使用该试剂盒，可以一次 实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆。此外，无缝组装试剂盒还兼容常规酶切、PCR 反应体系。克隆载体酶切产物或 PCR 产物以及插入片段 PCR 产 物可以不进行 DNA 纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。 产品特色： 1. 灵活的克隆位点：适用于向几乎任何载体的任何位点进行多片段拼接克隆。 2. 快速简便：30 分钟完成载体构建。 3. 精确：不会增加任何额外的序列 ，无需考虑插入片段自身携带的酶切位点。 4. 效率高：可一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆。 适用范围： 载体 DNA 片段克隆 基因定点突变 蛋白质表达 应用合成生物学 代谢工程 高通量克隆 操作流程： 1. 采用酶切或 PCR 扩增的方法将载体线性化。 2. 使用设计好的引物进行插入片段的 PCR 扩增。 3. 按下表将目的 DNA 片段和线性化载体以摩尔比 1:1 加入离心管 ： ddH O Up to 20μl 2 5x 反应 Buffer 4 μl 插入片段 x μl 线性化载体 y μl 无缝组装酶 2 μl 总体积 20 μl 每片段 （插入片段和载体）最适使用量 = [0.02 × 片段碱基对数] ng (0.03 pmol) 4. 混匀后在 37℃孵育 30 分种，然后转移到冰上放置 5 分钟。 5. 直接转化或者置于-20℃保存等需要转化时解冻转化。 和元无缝克隆试剂盒操作流程示意图 PCR 引物设计： 1. 引物的质量对重组反应的成功率有很大影响，因此强烈建议使用HPLC或PAGE纯化的引物。 2. 引物设计时应该在遵循常规引物设计原则的基础上，把15-20个同源碱基序列导入引物。 3. 两端引物设计：根据线性化载体末端的不同类型进行如下引物设计。 4. 中间重叠引物：上游和下游的片段之间有20bp的重叠区域 5’粘末端的载体引物设计 平末端的载体引物设计 3’粘末端的载体引物设计 PCR 产物进行无缝克隆流程图 注意：即使是无杂带无引物二聚体的 PCR 产物，经过 PCR 产物回收试剂盒或者胶回收试剂盒纯化后使用，可以提高转化的成功率