基因工程的基本操作程序讲稿.pptVIP

(一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 第二课时 * * 一、基因工程的概念： 又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 1.限制酶和DNA连接酶的作用分别是什么? 限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 DNA连接酶的作用是连接被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 1.2 基因工程的基本操作程序 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 一 原核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA 启动子 终止子 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 一 原核细胞的基因结构 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶 A G G T C A C G T C G T C C A G T G C A G C A G G U C A C G U C G RNA聚合酶 启动子 终止子 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 原核细胞不具有剪切、拼接mRNA的能力，所以真核细胞的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达 一、目的基因的获取 1、目的基因主要是指______________________ 编码蛋白质的结构基因 请举出三个以上的例子 2、获取目的基因的常用方法有哪些? （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （如:cDNA文库） 限制酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 1)基因组文库(Genomic library) 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 每个受体菌DNA分子都包含一段不同的 外源DNA片段 1）反转录法： 聚焦二：目的基因的获取方法 cDNA (互补DNA) 蛋白质 mRNA DNA 推测 推测 DNA DNA合成仪合成仪 合成 2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 根据已知氨基酸合成DNA法 反转录法 鸟枪法 缺点 优点 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗? 利用PCR技术扩增目的基因 问题:为什么要扩增目的基因? 原理:碱基互补配对 原料:4种脱氧核苷酸 条件: (1)引物:人工合成的一段核苷酸系列 (2)酶:DNA聚合酶 特点:快速(指数形式扩增) 过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 5/ 3/ G—G T—C 3/ 5/ G—A C—C 聚焦二：目的基因的获取方法 5/ 3/ 5/ 3/ 5/ 3/ G—G T—C 3/ 5/ G—A C—C 5/ 3/ 引物Ⅱ G—G 高温变性 低温复性 中温延伸 5/ 3/ A—G 引物Ⅰ 聚焦二：目的基因的获取方法 5/ 3/ 5/ 3/ (二)利用P