转TLR4基因的绵羊胎儿成纤维细胞系的建立-中国农学通报.PDFVIP

中国农学通报 2013,29(35):63-68 Chinese Agricultural Science Bulletin 转TLR4 基因的绵羊胎儿成纤维细胞系的建立 曹玉桃，李方舟，张全仓，顾美超，倪和民，刘云海，郭 勇 （北京农学院动物科学技术学院，北京102206） 摘 要：为了通过脂质体介导的方法获得高效表达目的基因TLR4 的绵羊胎儿成纤维细胞作为供体细 胞，以便在胚胎移植前的体外筛选过程中确定优越的转基因供体细胞，从而提高体细胞核移植生产抗病 转基因绵羊的效率。本研究通过优化脂质体与质粒载体的比例浓度，进而再去转染原代培养的绵羊胎 儿成纤维细胞，经G418 筛选，以EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein )作为报告基因，从形态学与 分子水平鉴定出已经稳定表达目的基因：Toll 样受体4(Toll Like Receptor4 ，TLR4)基因的细胞系。最终 经过筛选与纯化得到3 个表达目的基因TLR4 的细胞克隆，经RT-PCR 与相对荧光定量PCR 分析，在第 二代转染的细胞中TLR4 的表达最高，相对于未转染的绵羊胎儿成纤维细胞升高了9.65 倍(P0.01) ，并 藉此为最终制备抗病转基因羊新品种，从提供稳定表达TLR4 基因的转基因供体细胞系角度奠定基础。 关键词：绵羊；TLR4 ；胎儿成纤维细胞系；转基因克隆 中图分类号：S813.3 文献标志码：A 论文编号：2013-1116 The Establishment of Fetal Sheep Fibroblasts Cell Line Transfected with Vector Containing TLR4 Gene CaoYutao,LiFangzhou,ZhangQuancang,GuMeichao,NiHemin,LiuYunhai,GuoYong (CollegeofAnimalScienceandTechnology,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206) Abstract: InordertousetheLiposome-mediatedmethodtoobtain high-levelexpressionofTLR4genesheep fetalfibroblastcellsascompetentdonorcells,whichwasflexibleforthein-vitroscreenprogresstomakesure theeffectivedonorcellsbeforeembryotransplantation.Thepreparationofcompetentdonorcellwascriticalfor theproductionefficiencyoftransgenicsheepbysomaticcellnucleartransfer(SCNT).Inthisexperiment,the ovinefetalfibroblastwastransfectedbylipofectionwiththereconstructedvectorcontainingthetargetTLR4, neoandenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP,reportgene)genes.Then,theywereselectedbyG418and detectedbyEGFPpositively.Finally,thestabletransgenicovinefetalfibroblastcelllinebeingoverexpressed TLR4,wasestablishedbyidentificationfrombothmorphologicalandmolecularlevels.Theresultsshowedthat usingtheoptimizingratioofliposomeandthe TLR4 vectort