致泻性大肠杆菌中.pptVIP

致泻性大肠杆菌检验技术;概 念;致泻性大肠杆菌按照毒力因子、致病机理和流行病学特征分为5类 肠致病性大肠杆菌（EPEC） 肠侵袭性大肠杆菌（EIEC） 肠产毒性大肠杆菌（ETEC） 肠出血性大肠杆菌（EHEC） 肠聚集性粘附大肠杆菌（EAggEC） ;生物学性状;培养特性;在普通培养基上的菌落形态;生化特征-1;生化特征-2;抗原结构 ;致病物质与所致疾病; 肠产毒性大肠杆菌 ETEC是第三世界国家细菌性腹泻和旅游者腹泻的主要病原之一 ETEC分泌耐热肠毒素（ST）、不耐热肠毒素（LT），具有与致病性相关的菌毛等。 ETEC通过菌毛粘附在小肠上皮细胞，释放毒素ST和LT，刺激腺苷环化酶或鸟苷环化酶的生产，引起肠液分泌和聚积，产生水样腹泻。; 肠侵袭性大肠杆菌 EIEC的毒力因子和致病机制志贺氏菌基本一致，临床症状与细菌性痢疾不易区分，主要是发烧、腹部剧烈疼痛与不适、毒血症、水样腹泻，粪便中有少量粘液和血。 EIEC通常侵犯大肠，使大肠上皮细胞刷状缘发生局部破坏，细菌被摄入细胞内，侵犯并破坏细胞基底膜，在细胞内扩散、繁殖，并在细胞间扩散，引起细胞的死亡，造成炎症和溃疡。 EIEC的侵袭力由120～140MD的大质粒编码，与编码志贺氏菌侵袭力的大质粒高度同源，丢失了质粒的菌株也随之丧失。; 肠致病性大肠杆菌 EPEC是婴幼儿腹泻的主要病原菌，主要临床症状是发烧、呕吐、腹泻，粪便中含有大量粘液而无血，症状可持续两周以上，多引起社区的小型暴发。 主要毒力因子包括50~70KD大质粒编码的束状菌毛介导的粘附作用、噬菌体编码的志贺毒素及LEE毒力岛介导的A/E损伤。 ; 肠出血性大肠杆菌 EHEC是指能引起出血性肠炎的一群大肠杆菌，包括、026:H11、0111:H8、O125：NM、 O122:H19等血清型的部分菌株。 目前认为EHEC的主要毒力因子有志贺毒素、致病性大质粒和LEE毒力岛。 ;肠聚集性粘附大肠杆菌（EAggEC） EAggEC主要与小儿顽固性腹泻有关 EAggEC产生束状菌毛（AFF/ Ⅰ）和聚集性 粘附大肠杆菌毒素Ⅰ（EAST Ⅰ ） AFF/ Ⅰ和EAST Ⅰ 的基因位于60MD质粒上;样品的采集与处理;EPEC：婴幼儿水样或蛋花样便 EIEC：细菌性痢疾样便 ETEC：霍乱样水样便 EHEC：早期为水样便，后为血便;检验程序;直接分离培养;增菌培养;磁珠分离;结合：在18～30℃环境中，将上述Ep管连同磁板架放在适合的装置上转动或用手轻微转动10min，使E.coli O157与免疫磁珠充分接触。 注意： 室内温度 ，保证结合时间。 结合时不要将磁铁插入到磁板架中。 用手转动时应轻轻颠倒Ep管架，不可剧烈摇动。保证磁珠与O157的结合。 ;捕获：将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中和盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见的圆形或椭圆形棕色聚物。 吸取上清液：取1支灭菌的加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深入液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠积聚物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复2. 4步骤。每个样品换用1支加长吸管。;免疫磁珠的滑落：某些样品特别是那些富含脂肪的样品，其磁珠积聚物易于滑落到管底。在吸取上清液时，很难做到不丢失磁珠，在这种情况下，可保留50～100μL上清液于Eppendorff管中。如果在后续的洗涤过程中也这样做的话，脂肪的影响将减小，也可达到充分捕获的目的。 洗涤：从磁板架上移走磁板，在每个Eppendorff中加入1mL PBS-Tween20洗液，转动磁板架3次以上，洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤2.4～2.6。;重复上述步骤2.4～2.5 注意: 洗涤共3次，动作要轻柔。 吸取上清液至磁珠聚集物处时，应放慢速 度。上清液的吸取应尽量完全。 使用多块磁珠分离装置时，磁铁与磁铁应 远离放置。 免疫磁珠悬浮：移走磁板，将免疫磁珠重新悬浮在100μL PBS-Tween20洗液中。;涂布平板 用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板一侧，然后用涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36±1℃培养18～24h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板表面水分过多时，应在37℃下干燥10～20min，涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。;大肠杆菌在选择性琼脂平板