不同裂解方式对微生物DNA提取的影响.pdfVIP

江苏农业科学　２０１６年第４４卷第１２期 — ６１— 凌　云，王　晶，王越菲，等．不同裂解方式对微生物ＤＮＡ提取的影响［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（１２）：６１－６４． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．１２．０１５ 不同裂解方式对微生物 ＤＮＡ提取的影响 凌　云，王　晶，王越菲，彭自然 （上海海洋大学水产与生命学院，上海２０１３０６） 　　摘要：分子生物学试验中的细胞裂解及 ＤＮＡ提取是试验的第 １步，但是由于细胞种类多样、细胞壁成分复杂， ＤＮＡ提取的效果容易受到提取方法的影响。针对以上问题，主要研究溶菌酶、蛋白酶 Ｋ、十二烷基磺酸钠（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，简称ＳＤＳ）、十六烷基三甲基溴化铵（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，简称ＣＴＡＢ）等４种化学方法 对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌３种代表性细菌细胞的裂解效果。结果表明：溶菌酶＋ＳＤＳ法对３种 微生物的裂解效果都不错，但可能造成蛋白质污染且ＤＮＡ碎片较多；溶菌酶＋热冻法对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 的裂解效果较好且蛋白质污染较少；蛋白酶Ｋ＋ＣＴＡＢ法仅对金黄色葡萄球菌的裂解提取效果较好；溶菌酶＋蛋白酶 Ｋ法的提取效果最差。在试验中可以根据需要选择不同的裂解方式，从而达到操作性、重现性及经济性的统一。 　　关键词：微生物细胞裂解；ＤＮＡ提取；溶菌酶法；混合法；热冻法 　　中图分类号：Ｓ１８２；Ｑ９３３　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１６）１２－００６１－０３ 　　由于细胞壁结构的不同，细菌可分为革兰氏阳性菌 １．２　试验试剂 ＋ － ［１］ （Ｇ ）、革兰氏阴性菌（Ｇ ） 。革兰氏阳性菌的细胞壁主要 试验中所用到的主要试剂有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 成分是肽聚糖，其上附有磷壁酸；革兰氏阴性菌的细胞壁分为 （简称 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、乙二胺四乙酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ 内壁层、外壁层，内壁层由肽聚糖组成，外壁层主要由脂多糖、 ａｃｉｄ，简称ＥＤＴＡ）、ＣＴＡＢ、ＳＤＳ、ＮａＣｌ、ＮａＡｃ、蛋白酶Ｋ、溶菌酶、 ［２］ 蛋白质组成。细胞破碎的方法有很多 ，有机械法（如珠磨 无水乙醇、溶菌酶、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇等。 法、高压匀浆法、超声波法）和非机械法（如溶酶法、渗透压冲 １．３　试验仪器 击、干燥法、化学渗透法）。由于提取细胞内物质如 ＤＮＡ、 试验中所用的主要仪器：ＤＮＰ－９０５２型电热恒温培养 ＲＮＡ、活性物质等多数需要将细胞破碎，而机械法容易导致 箱、ＤＫ－Ｓ２２型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公 ＤＮＡ断裂，因此相关报道更多地集中在使用有机溶剂、抗生 司；ＲＪ－ＴＧＬ－１６Ｇ台式离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公 素、表面活性剂、螯合剂、变性剂等化学试剂进行细胞破 司；ＤＹＹ－６Ｃ型电泳仪，北京市六一仪器厂；ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ生 ［３－５］ 碎 。本试验以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌 物分光光度计，德国艾本德（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）股份公司；Ｂｉｏｓｔｅｐ凝 ３种实验室常用细菌为研究对象，采用溶菌酶、蛋白酶 Ｋ、十 胶成像分析系统，德国Ｂｉｏｓｔｅｐ公司。 二烷基磺酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，简称ＳＤＳ）、十六烷基三 １．４　试验方法 甲基溴化铵 （ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，简称 将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种于放有 ＣＴＡＢ）等４种常见化学试剂的不同组合对其细胞进行裂解， 培养基并已灭菌的培养皿中，于２５℃培养箱中培养２４ｈ，并 通过结合提取裂解后细胞破碎所释放出ＤＮＡ的效果，