实时荧光定量pcr技术及其在环境氨氧化细菌研究中的应用.pdfVIP

中国科技论文在线 实时荧光定量 PCR 技术及其在环境氨氧化细菌研究 中的应用 1 1 2 2 3 赵大勇 ，燕文明 ，冯景伟 ，袁守军 ，曾巾 1 水文水资源与水利工程科学国家重点实验室，河海大学水文水资源学院，南京(210098) 2 合肥工业大学土木与水利工程学院，合肥(230009) 3 污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京大学环境学院，南京(210093) Email ：dyzhao@ 摘 要：实时荧光定量PCR 技术是近年来新出现的一种核酸定量技术。本文综述了该项技术 的原理、特点及其在环境氨氧化细菌研究中的应用，同时也指出了该技术存在的问题及其发 展应用前景。 关键词：实时荧光定量PCR ，氨氧化细菌，分子生物学 中图分类号：X83 1．引言 实时荧光定量 PCR 技术（Real time fluorescent quantitative PCR, Real-time QPCR ）是在 常规 PCR 基础上发展起来的核酸定量技术。该技术是指在常规 PCR 反应体系中加入荧光染 料或荧光探针，通过检测荧光信号的强度来实时监测整个 PCR 过程，最后应用建立的标准 曲线计算出样品中特定DNA/RNA 的起始浓度，从而达到对目标核酸定量的目的。与传统的 PCR 技术相比，RT-QPCR 技术自动化程度更高，且克服了传统 PCR 存在的不能准确定量、 易污染、假阳性率高等缺点。 实时荧光定量 PCR 技术的原理最早由 Higuchi 等[1]在 Nature 上发表论文提出：使用 SYBR Green I 取代溴化乙啶（EB ）与核酸结合，并用改装的PCR 仪来检测样品的荧光强度， 第一台商业化设备在 1997 年开始投入使用[2] 。从此以后，RT-QPCR 在医学领域广泛地应用 于病毒以及致病基因的定量检测[3-4]，该技术在环境领域的应用开始于2000 年之后，主要用 于环境中特定微生物类群的定量分析[5-7]，以及环境因子改变对于特定微生物类群数量影响 的研究[8] 。 本文综述了 RT-QPCR 技术的原理、特点、存在的问题，以及该技术在环境氨氧化细菌 （Ammonia oxidizing bacteria ，AOB ）研究中的应用。 2 ．实时荧光定量PCR 技术的原理、标记方法和特点 2.1 原理 实时荧光定量 PCR 是向常规 PCR 反应体系中添加能产生特定波长荧光的染料或探针， 这些荧光染料和探针只有与目标核酸结合后才会发出荧光，通过特定仪器来检测荧光信号的 强弱，可以间接反映体系中目标核酸的数量，从而实现对整个 PCR 反应过程进行监控，检 测到的荧光信号的变化可以绘制成如图 1 的一条曲线。通过对收集到的荧光信号进一步处理 可以用于核酸样品的定量研究。 在 PCR 反应初期，由于目标核酸数量较少，所产生的荧光信号比较弱，背景值干扰较 大，用于定量误差较大。RT-QPCR 的可行定量是在PCR 扩增的指数期进行的。定量时，首 先引入循环域值数（Cycle threshold, Ct ）这个概念。它的含义是指在PCR 循环过程中，荧光 信号的增加由背景值进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数（图 1），一般以PCR 反应 的前 15 个循环的荧光信号作为背景值，以 3～15 个 PCR 循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍作为 PCR 反应进入指数期的荧光域值。在 PCR 反应的指数期，Ct 值与样品中核酸模版的 - 1 - 中国科技论文在线 起始拷贝数的对数存在线性关系（图 2 ）。 图 1 RT-QPCR 荧光强度变化曲线 Fig. 1 Relative fluorescence intensity curve of RT-QPCR