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基因工程实验指导书 THE EXPERIMENTAL GUIDE FOR GENE ENGINEERING 马月萍 崔振波 编写 东北大学理学院生物技术研究所 二零零六年一月实验须知 上好实验课是学好基因工程原理学的重要环节，它使同学们在验证课堂上所学理论知识、加深理解教师讲授内容的同时，还能使同学们得到基本实验技术、技巧的锻炼，为将来从事生物学基因工程方面的研究打下一定基础，因此必须予以足够的重视。为此，必须做到： 实验前预习实验指导书并复习有关内容 按实验指导及教师的要求进行观察，记载，写好实验报告，字迹要整洁、清楚。 爱护实验仪器、设备，注意节约药品和各种实验材料，按操作规程使用仪器，严禁私自拆卸仪器及调整仪器附件，如有损坏，照价赔偿。 注意安全，严格遵守操作规程，如遇特殊情况应及时报告指导教师。 保持实验室安静，不得在实验室内喧哗，不得迟到和早退，实验完毕将实验用品放回原来位置，各组轮流打扫卫生。  目 录 实验一 质粒DNA的小量提取与纯化 - 1 - 实验二 限制性内切酶消化质粒DNA - 5 - 实验三 感受态细胞的制备 - 7 - 实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA - 11 - 实验五 大分子DNA的制备 - 15 - 实验六 Southern杂交 - 19 - 实验七 RNA的制备及Northern杂交分析 - 25 - 参考文献 - 32 - 实验一 质粒DNA的小量提取与纯化 一 实验目的 1．学习质粒DNA的制备原理。 2．掌握用碱变性抽提法提取与纯化质粒DNA操作技术。 3．掌握水平式琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA技术。 二 实验原理 质粒是一类在细菌细胞内发现的，是存在于细胞质中的一类独立于染色体外，能够自主复制的环形双链的DNA分子。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒DNA编码的蛋白质往往赋予寄主细胞一定的表型特征，如各种抗性质粒、降解性质粒、致病性质粒等。 质粒DNA的提取与纯化是基因工程操作中常用的一项技术。质粒DNA的制备方法很多，其中常用的是碱裂解法小量制备质粒DNA。一般它们包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的提取；质粒DNA的纯化。 1．细菌的生长和质粒的扩增 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养，对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA，但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制寄主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。 2．细菌的收集、裂解和质粒DNA提取 细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。质粒DNA提取的基本原理是利用寄主菌（一般是大肠杆菌）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异： （1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。 （2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。 （3）环状质粒DNA较细菌的基因组DNA耐碱性强，细菌裂解物用碱性缓冲液处理后细菌的基因组DNA首先被裂解，通过离心与菌体碎片和各种蛋白质一起沉淀下来，环状质粒DNA存在于上清液中。 3．质粒DNA的纯化 纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。多年来，绿化铯-溴化乙锭剃度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的首选方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析，分级沉淀（聚乙二醇和LiCl分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。 质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA, SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。 三 实验器材、试剂及材料 1．实验器材 超净工作台、台式离心机、微量加样器、恒温培养箱、恒温摇床、核酸电泳仪、电泳槽、小型