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分子克隆技术 华中农业大学 生命科学技术院/作物遗传改良国家重点实验室B606 李一博 liyibo@mail.hzau.edu.cn 基因操作原理 基因工程 分子克隆技术 （DNA的无性繁殖技术） 三大实验任务 将一个1.5kb水稻DNA片段从一个载体亚克隆到另一个载体上（分子克隆） 水稻转基因植株的阳性鉴定及拷贝数检测 （分子杂交） 基因转录水平的表达检测RT-PCR（表达检测） 重组DNA 筛选鉴定 分离外源基因 载体 重组 转化子 受体细胞 分子克隆实验大致流程 通过转化载体的构建实验掌握下列操作: 分子克隆 质粒载体的抽提，外源DNA的准备 琼脂糖凝胶电泳 DNA的质量检测 载体与外源DNA的限制性内切酶消化 目的DNA片段的回收(载体的去磷酸化） 载体与外源DNA的连接 感受态细胞的制备 连接子转化感受态细胞 重组子的筛选、鉴定（挑克隆 - 抽质粒 - 测序） 酶切 PCR 扩增 cDNA 其它来源的DNA片段等 分子杂交： 转基因水稻的外源基因的拷贝数检测 DNA抽提 DNA酶切 酶切产物电泳 转膜 烘膜 预杂交 探针准备及标记 杂交 洗膜/显影或显色 12 1 2 3 4 5 6 7 9 (kb) 1 2 3 35 转基因植物拷贝数检测 Southern Blotting 植物总DNA的抽提 植物总DNA质量检测 DNA的琼脂糖凝胶电泳 限制性内切酶操作 Southern Blotting 探针的地高辛标记、杂交、免疫反应及显色 通过Southern杂交实验掌握： 基因表达分析 Northern Blotting RT-PCR Real Time PCR cDNA 芯片 RNA水平： RT-PCR (qRT-PCR) RNA抽提 cDNA 反转录 基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导 PCR Northern Blotting 基因表达分析的一般流程 Northern Blotting Invented by Kary Mullis in 1983 and Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993 基因表达水平 表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析 ladder c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 EI12I1 EI22F22 EI1K8 EI35I3 ?-actin A B C D E A: IRBB10 叶片接种 白叶枯（PXO86） C: C101A51 叶接种 稻瘟病（V86013） B: IRBB13 叶片接 种 白叶枯（PXO99） D: MH63 叶片接种 稻瘟病（V86013） E: MH63 叶片接种 稻瘟病（1366） （周斌，2001，硕士论文） 通过做RT-PCR掌握： 植物总RNA的抽提 RNA电泳 mRNA的反转录 PCR技术等 分子克隆实验注意事项 在整个实验过程中都应严格遵守实验室的规章制度，不准违规操作仪器（损坏物品的赔偿制度）； 离心机 ：平衡、离心管配套、转速； 移液器：不能超量程使用，不能倒置，小心摔坏；吸取、打出试剂时动作应轻柔；用过的tip不能丢到桌面上，应直接放到废物杯中； 对1.5ml、0.5ml 离心管的操作：手不能碰到内盖，不能对着打开盖子的离心管讲话； 化学药品：腐蚀性、诱变剂、放射性物质； 实验过程中和实验完毕注意水、火、电； 保持实验室安静、清洁。 有毒有害废弃物品的处理 废弃氯仿 、苯酚等有机溶剂：分类收集，标注清楚，通知学校负责部门（国资设备处）处理； 溴化乙啶：（1）加入活性炭吸附，过滤收集吸附了EB的活性炭，密封后送至相关机构或高温燃烧使EB彻底分解；（2）加入盐酸和高锰酸钾，使EB 氧化，然后加碱中和后丢弃；（3）购买商业 EB Eraser； 放射性废物：（1）半衰期短的核素：放置10个半衰期后丢弃；（2）半衰期长的核素：标注核素名称及相关信息，通知学校国资设备处将其交至专门的放射性废物处理保藏机构； 含有重组克隆的菌液或培养基的处理：高温高压灭菌后丢弃。 试剂配制注意事项 天平的使用：调水平、量程、清洁； 试剂的溶解度； 调pH； 是否需灭菌？高压灭菌还是过滤灭菌？ 是否需分装成小份？是否需冷藏或冷冻？ 用什么瓶子装（塑料瓶还是玻璃瓶？是否要避光等） 不同实验用到不同的buffer； 不同操作体系中各成份的用量计算。 已有的母液或试剂： 20×SSC; 10% SDS; 1M Tris.HCl (pH8.0, pH7.5); 0.5M ED