遗传学实验植物同工酶技术.PDFVIP

遗传学实验：植物同工酶技术 实验目的： 掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工 酶分析在遗传学研究中的意义。 着重掌握过氧化物酶(POD)的提取，电泳与 染色技术及分析方法。 实验原理：同工酶及生物学意义 同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相 同的酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构 不同的一族酶，受遗传体系决定。 同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性 等都有一定的关系，如过氧化物酶（POD）在细胞 代谢过程中参与呼吸作用，光合作用，及生长素的 氧化等，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一 时期植物体内代谢变化。 实验原理：POD同工酶电泳、染色 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可将不 同分子形式的同工酶分开，然后，用 专一的作用底物/染料，把需要分析 的酶染色，在凝胶上呈现同工酶谱。 醋酸联苯胺法染色植物POD同工酶 实验材料、器具 材料：植物幼嫩组织（可根据实验需要， 选择幼叶、幼苗或花朵等） 仪器/用具： (1)垂直板电泳装置（电泳 槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架 等）；(2)稳流稳压电泳仪；（3）离心 机；（4）电子天平；（5）电冰箱；（6） 微量进样器；（7）研钵 等 实验步骤：凝胶的制备 分离胶 7% 20 ml 浓缩胶 3 ％ 10ml 30% Acr-0.8% Bis 4.5 ml 1.0 ml 1M Tris-HCl (pH8.9) 15.3 ml -- 1M Tris-HCl (pH6.8) -- 1.0 ml TEMED 10 ul 10 ul ddH2O -- 7.9 ul 10% AP （最后加入） 200 ul 100 ul 按照以上配方配置、灌制聚丙烯酰胺凝胶 实验步骤：酶粗提液的制备 称取幼叶片/花朵0.5g → 加样品提取 液（水/电泳缓冲液）0.5ml →于冰浴 快速研成匀浆→ 匀浆转移至EP管 →10000转/分钟，离心10min → 取上 清液50ul于另一小EP管 →以等量50% 蔗糖混合 → 低温放置待用。 实验步骤：电泳、剥胶、染色 取20～40ul酶粗提液与一小滴溴酚蓝混 匀 →上样于凝胶孔→ 60 V 电泳至样 品进入分离胶→100 V电泳至溴酚蓝泳 动至胶底部约1cm处 → 停止电泳→ 剥胶 → 水洗一次→醋酸联苯胺染液 染色至条代清晰→去染色液，水洗终 止染色→拍照或扫描。 结果与分析:以蝴蝶兰自交花色遗传为例 98 1 亲 本 F1 98 98 1 2 3 a b 2 3 c