STAT3shRNA表达载体使用说明-Viagene.DOCVIP

STAT3 shRNA表达载体使用说明 背景简介： 1998年，RNA干扰（RNAi）作为一项重大发现出现在基因组学领域。但RNAi在哺乳动物细胞中容易引起细胞毒反应，要求新的阻断mRNA翻译的方法出现――短小的双链RNA序列（siRNA）干扰。mRNA被siRNA破坏的机理很简单：通过Dicer酶作用，siRNA结合到被称为RNA诱导沉默复合物（RISC）的多体蛋白核酸酶复合物上。siRNA的正义链与靶mRNA的同源性使该复合物结合于mRNA上，并将mRNA降解为小片段，实现哺乳动物模型中特定基因的表达沉默。siRNA具有高效性和高度特异性，必将得到广泛应用。 STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3）――信号转导和转录激活因子是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白，是STATs七个家族成员之一。STAT3最初是作为一种急性期反应因子被发现，由IL-6激活。STAT3在多种组织中都有表达参与了正常细胞的存活、增殖、凋亡等重要活动。多种肿瘤细胞中STAT3均有异常高表达，过度激活导致细胞的异常增殖和凋亡障碍STAT3阻断治疗及阻断机制STAT3信号通道可能成为肿瘤基因治疗的一个新的作用靶位。RNA（shRNA）表达载体的转染法。采用特别设计的载体来表达shRNA比寡核苷酸技术有更多的优越性。最显著的优点是载体表达的shRNA非常稳定，用带有启动子的载体可以使shRNA在细胞内长期表达。载体法适用于培养细胞及动物体实验，也是基因治疗应用的理想手段。 Viagene公司的STAT3/shRNA载体组合是将STAT3 shRNA序列克隆到人源U6启动子的下游，用其转染动物细胞后，可产生大量针对STAT3的shRNA。STAT3/shRNA表达载体总共有2189对碱基，适合于STAT3基因表达的Transient抑制。 试剂盒清单： 目录号 RNIS005 STAT3 shRNA 载体 20ug/40ul STAT3突变载体 10ug/20ul 空白对照载体 10ug/20ul 所需的其他材料： 1. Lipofectamine-2000 (Invitrogen，Cat#:1668-027 或11668-019) 2. Opti-MEM-I培养液 (Invitrogen，Cat#:31985-062) 3. 标准的细胞培养设备与材料 转染操作： 本实验的操作过程以使用Invitrrogen公司的Lipofectamine-2000 在六孔细胞培养板上转染HeLa细胞为例。如果您使用其他的细胞转染剂或不同的细胞株，请根据相应的操作说明进行。 细胞培养器 培养液体积 载体（μg）和稀释体积（μl） 96孔 100 μl 0.15μg稀释至25μl 24孔 500 μl 0.6μg稀释至50μl 12孔 1 ml 1.0μg稀释至100μl 35mm 2 ml 2.5μg稀释至250μl 6孔 2 ml 2.5μg稀释至250μl 60mm 5 ml 5μg稀释至0.5ml 进行转染操作的前一天，将浓度为2-4×105 的细胞放入2ml的培养液（含血清但没有抗菌素）中，使细胞一直处于增殖状态。转染当天，附壁的细胞的覆盖率需达到培养面的70-80％。注意：较低的覆盖率，能保证细胞在3天的孵化生长期间有足够的表面区域去生长。 用100μl Opti-MEM-I培养液稀释2.5μg (5ul) 的STAT3 shRNA载体及对照载体。 用100μl的Opti-MEM-I培养液稀释6μl的Lipofectamine-2000，并在室温下孵化5分钟，切不可延长。此稀释液可大量配制以用于多个孔板。 提示：Lipofectamine-2000一经稀释则不能保存。 在37℃、CO2孵化培养箱中培养细胞2-3天。也可以在细胞培养12-18小时后，将培养液更新一次（注意操作时保证细胞粘附在细胞培养板上）。 样品制备与结果鉴定： 验证STAT3 shRNA所引起的基因表达沉寂作用可以在蛋白质或mRNA水平进行。本说明的以下部分列出了在蛋白质水平检查STAT3的表达的总量的方法。在一些哺乳动物细胞株中STAT3蛋白的降解率很低。因此，即使STAT3 shRNA引起STAT3基因表达的完全抑制，细胞中原已生成的STAT3蛋白会存在相当时间而干扰分析结果。在这种情况下，有必要采用分析STAT3 mRNA的方法，如RT-PCR，Northern印迹分析或实时PCR等分析技术，请参照有关技术进行。 将细胞培养板中的培养液吸出，注意不要伤害正在生长的细胞。 用Laemmli SDS细胞裂解液制备细胞溶胞液。如果是12孔板，每孔加80μl细胞裂解液；如果是6孔板，