CD24在人胚肾上皮细胞Hek293中表达及检测.doc

CD24在人胚肾上皮细胞Hek293中表达及检测[摘要] 目的 构建含有CD24基因的重组质粒，在人胚肾上皮细胞Hek293中表达出具有免疫原性的抗原。方法 用PCR方法扩增CD24基因，克隆到载体pYD5-hFC中，获得重组质粒pYD5-CD24，转化DH10α感受态细胞中，挑选克隆抽取质粒，以脂质体介导将质粒转染Hek293细胞，72 h后收集细胞培养上清，Western-Blot分析鉴定。结果 构建了含有CD24基因的重组质粒，并在人胚肾上皮细胞Hek293中获得带有hFC标签的CD24蛋白。结论 本研究成功表达出了具有免疫原性的CD24蛋白。 [关键词] CD24；表达；Western [中图分类号] R741 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）29-0047-02 CD24基因编码唾液酸糖蛋白锚定在细胞表面糖基磷脂酰肌醇链上，在成熟的粒细胞和许多B细胞中都有表达[1]，它作为黏附分子对调节肿瘤细胞生长、增殖及侵袭等均具有重要作用[2]，且其高表达及表达模式与患者生存率及预后密切相关，是多种肿瘤有价值的诊断和预后指标[3]。 真核表达系统表达水平高，表达产物可进行翻译后加工，其抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似等特点，被广泛应用于各种不同外源基因的表达。本文以真核表达系统表达CD24基因，对表达产物的特异性进行鉴定，并对核蛋白的免疫原性进行初步研究，为CD24基因工程亚单位疫苗的研制及诊断抗原的研究做进一步的探索。 1 材料与方法 1.1材料 CD24模版购自美国open biosysterms公司，DH10α感受态细胞自己制备，限制性内切酶HindIII、BamHI购自NEB公司，T4连接酶、 Taq DNA聚合酶购自美国TAKARA公司，Hek293细胞株、F17培养基、F68、脂质体cellfectine、抽质粒试剂盒均购自invitrogen公司，Anti-CD24鼠抗购自Abcam公司，HRP标记羊抗鼠IgGFc购自Sigma。 1.2 细胞培养 细胞培养参照文献[4]进行，具体步骤如下，Hek293细胞培养基：F17无血清培养基，培养条件：27℃，5%CO2。悬浮培养：细胞接种到无菌的三角瓶置于恒温摇床培养，转速120转/min，加入1%的F68，悬浮细胞密度一般维持在（0.5×106~1×106）cells/mL之间，一般传代（2～3）次/周。 1.3 目的基因扩增 根据CD24模板，PCR扩增全长基因。上游引物P1为5GCCGTCTCGGATCCATGGGCAGAGCAATGGTGGC 3’，5端加上BamHI酶切位点；下游引物P2为5GCCGTCTCAAGCTTAAGAGTAGAGATGCAGAAGAG 3’，5端加上HindIII酶切位点。扩增片断为240 bp，含有完整的CD24基因，引物由南京金思特科技有限公司合成。 1.4重组质粒构建 将PCR产物CD24经BamHI和HindIII双酶切，酶切条件：37℃，2 h，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离回收（按说明书操作），回收的目的片段与pYD5载体连接，连接产物pYD5-CD24热击转化大肠杆菌感受态DH10α，涂布LB平板（平板中含有Amp），37℃培养过夜，挑独立的克隆接种于10 mL LB培养基中（Amp）震荡培养过夜。 1.5酶切及测序 收集细胞抽质粒进行酶切鉴定，1 mL送测序，1.5 mL保种。若测序正确，将保存菌种扩大培养抽质粒（按Invitrogen公司试剂盒说明书操作）。 1.6细胞转染及表达分析 转染在6孔板中进行，当细胞生长密度达到1×106 cells/mL时，利用脂质体（cellfectine）介导转染，转染后72 h左右收集细胞培养上清加入 loadingbuffer制得裂解液，根据Western bloting常规操作做WB检测。一抗：CD24单克隆抗体。二抗：是HRP标记羊抗鼠IgGFc。 2 结果与分析 2.1 目的基因扩增结果 PCR扩增出的CD24基因，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大约240 bp的特异性条带，与预期片段大小相符（图1）。 图1 CD24的PCR分析 1：2000 marker；2：CD24 2.2 重组质粒鉴定结果 重组质粒pYD5-CD24转化感受态细胞DH10α，在含有氨苄抗生素的LB培养板上挑取独立克隆培养，抽出质粒进行双酶切，酶切结果如图2。酶切后得到大约6 kb和240 bp两片段，分别与pYD5载体和CD24基因分子质量一致。测序结果证明载体pYD5和CD24基因接头连接处正确，大小和读码框架正确完整。 2.3 Western b