Mucin—4在百里醌抑制肝癌生长中作用.docVIP

Mucin—4在百里醌抑制肝癌生长中作用 　　[摘要] 目的 探讨百里醌对体内外肝癌生长的影响，并对其机制进行初步探讨。 方法 不同浓度百里醌作用人肝癌细胞株SMMC-7721后，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测其对细胞生长的抑制作用；Hoechst染色后荧光显微镜下观察细胞形态学变化；RT-PCR检测Mucin-4 mRNA在SMMC-7721细胞中的表达；Western blotting检测肝癌细胞中Mucin-4蛋白表达；建立裸鼠肝癌皮下移植模型，完全随机法分为对照组和低（10 μmol/L）、中（20 μmol/L）、高剂量（40 μmol/L）百里醌组，观察不同剂量百里醌对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长的影响；免疫组织化学法检测肿瘤组织中Mucin-4的阳性表达。 结果 不同浓度（10、20、40 μmol/L）百里醌作用人肝癌SMMC-7721 24 h后，细胞存活率分别为（80.14±9.84）%、（71.68±6.51）%和（64.58±5.24）%；百里醌作用后，SMMC-7721细胞出现典型凋亡形态学改变；百里醌干预后SMMC-7721细胞中Mucin-4蛋白和mRNA的表达均明显下调，呈浓度依赖性；实验结束后，对照组和低、中、高剂量百里醌组肿瘤体积分别为（1056.3±236.3）、（672.3±178.8）、（529.4±165.7）、（473.1±141.5） mm2，各百里醌组肿瘤体积明显低于对照组（P 　　[Key words] Liver cancer；Thymoquinone；Mucin-4 肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，全球癌死亡率排第3位，预后差，死亡率高，严重危害人类的健康和生命[1]。目前肝癌治疗的方法主要是手术治疗，而外科手术对早期实体瘤的患者较为有效，对复发、晚期及微小病灶的患者则达不到根治的目的，目前仍以化疗为主，但当前治疗肝癌的传统化疗药物存在疗效低、毒副作用大等缺点[2]。因此，找到疗效较佳且不良反应较低的药物成为肝癌治疗研究的重点与热点。百里醌是由一种生长于地中海和印度边界地带的草本植物——黑种草籽中提取出来的具有生物活性成分的单体，已有大量动物试验研究表明它的抗癌效果显著，目前已将其用于临床Ⅰ期试验[3-6]。迄今为止，临床中对于百里醌在肝癌患者癌细胞控制中的研究还相对缺乏，故认为对其进行研究极为重要，以为其临床应用提供依据。 1 资料与方法 1.1 细胞培养及计算方法 将实验细胞培养于10%的胎牛血清（美国Gibco公司，批号117573600）中，温度保持在37℃，二氧化碳浓度为5%。另以四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法进行细胞增殖方面的检测，主要为将对数生长期为SMMC-7721的细胞进行单细胞悬液的制作，其中培养基为RMPI-1640培养基（美国Gibco公司，批号，采用96孔培养板进行制作，以200 μl/孔加入，然后将10、20、40 μmol/L的百里醌（美国Sigma公司，批号：87126）加入，注意加入时机为细胞完全贴壁后方可加入，另外注意设定空白调零孔，仅将其加入1%的乙醇，而空白对照组则在加入细胞的基础上再加入1%的乙醇，上述指标分别培养24、48、72 h，另外将MTT液加入后，再静置4.0 h后结束培养，然后以二甲基亚砜（DMSO）加入，并轻微震荡10 min，然后进行相应检测及光密度（OD）值检测，同时观察及计算每个培养基的细胞存活情况。其中细胞存活率的计算方式为（实验组OD值-空白调零组OD值）/（对照组OD值-空白调零组OD值）×100%。 1.2 荧光显微镜下观察细胞形态变化 对数生长期SMMC-7721细胞经不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用24 h，吸弃培养液后用PBS洗2次，加入40 g/L多聚甲醛液固定10 min；吸去固定液，以蒸馏水清洗1次，用Hoechst 33258染色液（5 mg/L）染色10 min；再用蒸馏水清洗2次后，自然干燥后，在荧光显微镜下以340 nm激发光观察并随机拍照。 1.3 RT-PCR检测 SMMC-7721细胞中Mucin-4 mRNA的表达：不同浓度百里醌（10，20，40 μmol/L）作用SMMC-7721细胞24 h；后，将其进行总RNA的提取，严格按照Trizol试剂相关说明书进行提取，并在260 nm及280 nm下进行检测，以PCR扩增法进行检测，其中引物设计为，Mucin-4上游引物：5′-GATTCAAATTCAGATGGGAGCAA-3′，下游引物：5′-CGTCCCGAATCGAAAGACCA-3′（235 bp）；GAPDH上游引物：5′-GTCGAATCCACGAAACTAC-3′，