免疫学技术项目五 ELISA-酶联免疫吸附法.ppt

ELISA-酶联免疫吸附法 必备知识 任务1 ELISA 双抗夹心法测HBsAg 任务2 ELISA 双抗夹心法测马铃薯病毒 任务3 ELISA 间接法测人抗核抗体（ANA） 任务4 ELISA 竞争法测人雌二醇E2 酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay 定义： 是一种将抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。 基本原理 使Ag或Ab吸附到固相载体表面，并保持其免疫活性； 使Ag或Ab与某种酶连接成酶标Ag或Ab；酶标Ag或Ab既保留其免疫活性，又保留酶的活性； 测定时，把受检标本(测定其中的Ab或Ag)和酶标Ag(或Ab)按不同的步骤与固相载体表面的Ab(或Ag)起反应 必要的试剂： ① 免疫吸附剂：吸附于固相的Ag或Ab； ② 酶结合物：酶标记的Ab 或Ag； ③ 酶作用的底物 常用的酶与底物： ELISA类型 2、竞争法 Ab+ Ag(?)-E Ab-Ag-E(显色) Ag 2、间接法 ELISA 双抗夹心法测HBsAg 试剂盒中的材料 板子：96孔凹型板（锡纸、干燥袋） 2个封膜：说明要反应两次。封法？作用？ 自封袋：用处？ 说明书（1份） 试剂：20×洗涤液（PBS+吐温80）20ml 酶结合物：是酶标抗原or 酶标抗体？ 显色剂 ：A 四亚基联苯胺 B 黑瓶（why?） 终止液：2mol/L H2SO4 任务2 ELISA 双抗夹心法测马铃薯病毒 目的 1、掌握ELASA法的实验原理。 2、掌握实验操作的基本技能 3、熟悉ELASA法中应用的各种试剂的配制。 原理 抗原与抗体具有特异性结合的性质，以此作为依据，检测相关的抗原或是抗体。方法中有3种必要的试剂： 1、固相的抗原或抗体：将抗原或抗体固定，使样品中的抗体或是抗原通过特异性结合，同样被固定。一般以酶联板作为固相载体，抗原或是抗体以物理的方式吸附在板上，酶联板是一串相连的小孔，每孔的体积为300ul，8×12排列，每块板96孔。有完全固定的和可拆卸的两种，后者更为常用。可拆卸的，即将12个孔或是8个孔连在一起，板只作为盛放小孔的架子，实验者可根据实验的具体情况来选择孔的使用数量，极为方便。（反应当中未用的孔必须封闭住，不然会影响它的使用） 2、酶标记的抗体或抗原：将酶用化学的方法与抗原或是抗体连接在一起。酶采用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的最多，但酶不同对应的底物也不同。 3、底物：不同的酶可以催化相应的底物产生颜色，底物的浓度是固定的，酶的含量直接决定颜色的有无与深浅，通过直接观察、酶标仪、分光光度计判定结果。 4、具体方法： 双抗体夹心法：双抗体夹心法一般用于检测抗原，显示颜色的深浅与抗原含量成正比。 竞争法：竞争法一般用于检测抗体，显示颜色的深浅与抗体含量成反比。 1、实验仪器 酶标板、移液枪、研钵、酶标抗体、底物、离心机、恒温水浴锅、 2、实验材料 抗体、包被缓冲液、抽提缓冲液、酶标抗体缓冲液、底物缓冲液、PBST。 1、配制相关溶液： （1）PBST洗液：溶于蒸馏水中至100mL NaCl 8.0g Na2HPO4 (无水) 1.15g Na2HPO4 ·12H2O 2.89g KH2PO4(无水) 0.2g KCl 0.2g Tween-20 0.5mL (PH7.4) （2）包被缓冲液：溶于蒸馏水中至100mL 无水碳酸钠 1.59g 碳酸氢钠 2.93g (PH9.6 4℃保存) （3） pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液 柠檬酸 （19.2g/L）24.3mL 磷酸盐溶液 （28.4g/L Na2HPO4/L）25.7mL，两者混合后再加蒸馏水50mL。 2、包被抗体 用移液枪吸取100ul包被抗体，沿孔壁准确滴加0.1mL至每个酶标板孔中，防止气泡产生。置于一个湿度大的盒子里，室温放置4小时或于4℃冰箱中过夜。 3、洗板：将孔中的包被抗体倒入水槽