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实验报告氨基酸的纸色谱法 实验三__纸色谱 实验三 纸色谱 一、实验原理、方法、注意事项 1、原理 纸层色谱为在纸上将混合物进行分离的色谱方法，分为分析型和制备型纸层色谱。多数 情况下，纸层色谱的原理属于分配色谱原理，色谱滤纸为支持剂，滤纸纤维可以吸附25%～ 30%的水分，其中6～7%的水分和滤纸结构中的羟基以氢键结合，为固定相。其他溶剂可 自由通过，为流动相。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断 分配而得到分离。物质被分离后在纸 色谱图谱上的位置用Rf值（比移值）来表示： Rf值 = 原点到色谱点中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离 在一定条件下某种物质的Rf值是常数，其大小受物质的结构、性质、溶剂系统物质组 成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等多种因素影响。此外，样品中的盐分、其他杂质 以及点样过多均会影响的有效分离。但由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实 验条件下与对照物质对比以确定其异同。作为药品的鉴别时，供试品在色谱中所显主斑点的 颜色（或荧光）与位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。作为药品的纯度检查时， 可取一定量的供试品，经展开后，按各药品项下的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色 （或荧光）的强度。作为药品的含量测定时，将主色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测 定。 无色物质的纸色谱图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸纸色谱图谱常 用茚三酮显色法鉴定。纸层色谱适用于极性较大的亲水性化合物或极性差别较小的化合物的 分离。 2、实验方法 之饱和，一般可在展开室底部放一装有规定溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展 开室内壁上，放置一定时间，俟溶剂挥发使室内充满饱和蒸气。然后添加展开剂使浸没溶剂 槽内的滤纸，展开剂即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，取出滤纸， 标明展开剂前沿位置，俟展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑点。 (2) 上行法 点样方法同下行法。展开室内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气饱和后，再下降悬钩， 使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm,展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，除另有规定外， 一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定方法检视。 展开可以向一个方向进行，即单向展开；也可进行双向展开,即先向一个方向展开,取出， 俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90°,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展 开、连续展开或径向展开等。 3、注意事项 [1] 层析纸使用前，应在烘箱中干燥，具体方法为100度的温度下，烘1~2小时。否则会 产生拖尾现象。 [2] 画线时只能使用铅笔，不能使用其它的笔。其它笔的颜色为有机染料，在有机溶剂中 染料溶解，颜色会产生干扰。 [3] 无论是画线还是点样，不能用手接触层析纸前沿线以下的任何的部位，因为，手指上 有相当量的氨基酸，并足以在本实验方法中检出干扰实验。 [4] 纸层析须在密闭容器中展开。加入展开剂后，再等20分钟左右，使标本缸内形成此 溶液的饱和蒸汽。 [5] 喷有显色剂的层析纸，在烘干时应注意温度的控制，温度太高，不但氨基酸会产生颜 色，茚三酮也会产生颜色干扰实验现象。 [6] Rf值随分离化合物的结构，固定相与流动相的性质、温度以及纸的质量等因素而变化。 当温度、滤纸等实验条件固定时，比移值就是一个特有的常数，因而可作定性分析的依据。 二、实验——用纸色谱法分离氨基酸 （一）实验目的 通过对氨基酸的分离，学习运用纸色谱法分离混合物的基本原理，掌握纸色谱的操作方 法。 （二）药品和仪器 1．仪器 层析缸毛细管(内径为0.5mm) 层析纸 喷雾器 7.5cm×15cm标本缸 新华1号(5×14cm。)直尺、 铅笔 2．试剂 0.1％甘氨酸水溶液 0.1％亮氨酸水溶液 0.1％茚三酮乙醇溶液 正丁醇 甲酸 未知液 （三）实验原理 （参见本节一、1、） （四）实验步骤 1、层析纸的准备： 将活化[1]的一张5×14厘米的层析纸条，在离底边1.5厘米处用铅笔[2]画一直线作为始 线，在起始线上点A、B、C三个点，各点之间的距离为1.5厘米，A、C两点分别离层析纸 边为1厘米，在起始线7厘米处画一直线作为溶剂前沿线[3]。见图5。 2、点样。 取内径约0.5mm的毛细管三小段，分别插入试样溶液中，借毛细虹吸现象吸取溶液少 许，在A上点甘氨酸溶液，B上点未知液，C上点亮氨酸溶液，样点的直径约2～3mm，如 溶液太稀，第一次点样，吹干后，再点第二、第三次，每次都要点在同一位置上。 3、展开： 将30毫升展开剂（正丁醇：甲酸：水/5：3：2）倒入层析缸中，盖上盖子，饱和20分 钟后[4]，再将点好样品的层析纸上端用回形针别住，把层析纸悬挂在层析缸盖的钩上，使层 析纸的底边浸入展开剂0.5厘米，