3催化机制-3.ppt

第八节 酶作用机制的研究方法 采取多种研究手段进行理论研究； 获得相关实验数据经推理提出一种学说； 或先提假说再进行实验验证； 提高到理论高度。 酶作用机制研究方法 X射线衍射法(link) 中间产物检测法(link) 酶分子修饰法(link) 酶反应动力学法(link) 一、X射线衍射法 晶体点阵结构的周期(点阵常数)和X射线的波长同一个数量级(10-10 m），这样诸原子或电子间产生的次级 X射线就会相互干涉，可将这种干涉分成两大类: 1、次生波加强的方向就是衍射方向，而衍射方向是由结构周期性（即晶胞的形状和大小）所决定。 测定衍射方向可以决定晶胞的形状和大小 2、晶胞内非周期性分布的原子和电子的次生X射线也会产生干涉，这种干涉作用决定衍射强度。 测定衍射强度可确定晶胞内原子的分布 X射线衍射法分析蛋白质分子的结构 1.制备蛋白质的晶体2.制备重金属衍生物3.衍射数据的收集4.相位问题5.电子密度图作电子密度图，从图上我们可以看到待测蛋白质的结构信息。6.精化 1、作用 （1）探测活性中心必需基团，进行中心部位定位； （2）研究酶底物结合模式； （3）比较前后图，研究酶分子和底物构象改变信息。 2、局限性及解决方法 数据获取时间长； 解决方法： （1）单底物反应：反应平衡极端趋向一个方向，直接获得酶与底物中间复合物；将此复合物结晶就可研究结构。 （2）底物结构类似物。 即竞争性抑制剂，由于其结构与底物类似可与酶活性中心结合并稳定。 注意事项： 酶的结晶； 酶与底物复合物难以结晶； 交联剂对酶晶体交联处理，再与底物溶液反应。 二 中间产物检测法 对稳定的中间产物进行检测是获取酶催化过程最直接方法； 检测方法：化学、光学、同位素。 条件：足够稳定的中间产物； 方法： 1、改变pH。使中间产物分解速度减慢； 2、降温。使中间产物分解速度减慢； 3、捕获剂。如醛缩酶催化1，6-二磷酸果糖，硼酸氢钠把中间产物薛夫碱捕获。 三 、酶分子修饰法 原理：通过对酶分子的侧链基团修饰、氨基酸置换等方法了解各种残基及侧链基团在酶催化过程中作用。 先认识酶活性中心的结构特点 某些酶活性部位的AA残基 酶 AA残基数 活性部位的AA残基 核糖核酸酶 124 His12, His119, Lys41 溶菌酶 129 Asp52, Glu35 胰凝乳蛋白酶 241 His57, Asp102, Ser195 胃蛋白酶 348 Asp32, Asp215 木瓜蛋白酶 212 Cys25, His159 羧肽酶A 307 Arg127, Glu270,Tyr248,Zn2+ 2. 酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间结构。 活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。（邹承鲁研究酶变性的工作） 3. 酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合（induced-fit）. 4. 酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙（crevice）内.裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。 5. 底物靠许多弱的键力与酶结合。 用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团 （一）侧链化学修饰 原理：对酶分子氨基酸残基进行侧链基团修饰，若修饰后的酶活性大大降低表明被修饰的基团可能是酶分子活性中心的必需基团。如： 1.用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团； 2.亲和标记（合成底物类似物）； 3.—SH保护剂的使用； 存在的问题：专一性。 提高专一性方法 原理：多个相同侧链基团不同环境活性不同，选择活泼的基团修饰。 如：牛肝谷氨酸脱氢酶每一个亚基有30个赖氨酸残基，其中只有一个可以被三硝基苯磺酸修饰。 2、适宜的化学修饰剂 （1）根据侧链基团特性选择专一性化学修饰剂（表3-2) ； (2)根据修饰剂反应活性次序选择修饰剂(表3-3);如：烷基化剂比酰化剂更易修饰赖氨酸。 （3）改变pH改变修饰剂特性。 如：碘乙酸在pH7.0下，主要修饰半胱氨酸（E-CH2S-），在pH6.0下，修饰蛋氨酸（E-CH2CH2SCH3） 3