金发草lea3基因两个剪接体转化酿酒酵母的抗非生物胁迫功能分析.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（８）：３０３５ 金发草ＬＥＡ３基因两个剪接体转化酿酒酵母 的抗非生物胁迫功能分析 １ ２ １ １ 李　锐 　王文国　范林洪 　王胜华 （１四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室　成都　６１００６４） （２农业部沼气科学研究所 生物质能技术研究中心　成都　６１００４１） 摘要　对金发草（Ｐｏｇｏｎａｔｈｅｒｕｍｐａｎｉｃｅｕｍ）第３组ＬＥＡ蛋白（ＰｐＬＥＡ３）基因两个剪接体进行分析， 并利用酿酒酵母表达系统分析两个剪接体在不同非生物胁迫的响应差异。以ＰｐＬＥＡ３基因两个 剪接体（ＰｐＬＥＡ３．ａ和ＰｐＬＥＡ３．ｂ）的重组载体ｐＭＤ１９ＴＰｐＬＥＡ３．ａ和ｐＭＤ１９ＴＰｐＬＥＡ３．ｂ为模板， ＰＣＲ法构建酵母表达载体ｐＹＥＳ２ＰｐＬＥＡ３．ａ和ｐＹＥＳ２ＰｐＬＥＡ３．ｂ，并转化酿酒酵母细胞得到重组 菌ＩＮＶＰｐＬＥＡ３．ａ和 ＩＮＶＰｐＬＥＡ３．ｂ。通过比较重组菌和对照菌（转空载体 ｐＹＥＳ２）在 ＮａＣｌ、 ＮａＨＣＯ、低温、干旱、ＵＶ胁迫下的恢复生长状况，结果表明两种重组菌胁迫后的生长情况明显好 ３ 于对照菌，两个剪接体对非生物胁迫抵抗力的大小为：ＰｐＬＥＡ３．ａ＞ＰｐＬＥＡ３．ｂ。两个剪接体在核 酸序列上的差异导致了在蛋白亲水性和结构上的差异，最终导致了在抗逆能力方面的差异。 关键词　ＬＥＡ３基因　金发草　可变剪接　转基因酵母　非生物胁迫 中图分类号　Ｑ８１９ 　　真核生物的可变剪接可以使一个基因产生多种 良好体系，被广泛地应用到复杂基因功能研究中［１１］。 ｍＲＮＡ转录本，翻译为多种多肽序列，这一过程会使蛋 本课题组已经获得了金发草ＬＥＡ３基因的两个剪接体， ［１］ ［１２］ 白质的多样性大大增加 。与此同时，由于可变剪接 该基因的第二个内含子可以保留形成可变剪接 。本 会导致肽链氨基酸的增加或减少，在空间结构上会引 研究将金发草ＬＥＡ３基因两个剪接体连接到酵母表达 起一定的变化，从而使其功能产生一定的变化，这为研 载体上，并转化酿酒酵母菌株 ＩＮＶＳＣ１，检测酵母重组 究蛋白质结构与其功能之间的关系提供了一条可选择 子在非生物胁迫下的存活率，通过酿酒酵母表达系统 的途径。由于可变剪接与人类的癌症等疾病有关，目 鉴定这些差异在细胞内产生的耐受性的差异，以期深 前对于可变剪接的研究主要集中在人类和其他动物方 入了解金发草ＬＥＡ３基因的功能及导致基因功能变化 面［２３］ ［４］ 的原因，为进一步研究金发草ＬＥＡ３基因异构体剪接异 ，对于植物方面的研究相对较少 。 　　ＬＥＡ蛋白是植物中较为重要的一类抗逆蛋白，已 构的生物学意义奠定了基础。 经在多种植物中被发现，并对其结构和功能作了进一 １　材料与方法 步的研究。尤其是对第三组ＬＥＡ蛋白，该蛋白在植物 耐受干旱胁迫、冷胁迫、盐胁迫等方面发挥重要作用， １．１　菌株与试剂 ［５８］ 　　 大肠杆菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０、酿酒酵母 并且在代谢中也起分子伴侣和亲水性溶质的作用 。 但其具体的作用机制大多限于推测，而实验证明较 ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｓｔｒａｉｎＩＮＶＳＣ１（ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ＭＡＴａ а ［９１０］ 少 。