基因工程抗体研究综述.doc

基因工程抗体 第一节　　抗体总论 抗体研究历史 （一）抗体一词的由来 抗体的实验研究始于上世纪末，1888年Emile及Alexander Yersin由白喉杆菌的培养上清分离到可溶性毒素，后者注入动物内可引起典型的白喉发病症状。Von Behring及同事Kitasato(北里)报告，以白喉或破伤风毒素免疫动物后，其血清中可产生一种中和毒素的物质，该物质能阻止毒素引发的疾病，来自实验动物的抗血清用于感染的患儿，获得明显的治疗效果，尤其是在发病的早期。于是将能中和毒素的物质称为抗毒素(antitoxin)，antigen）。1896年Gruber和Durham发现了凝集素。1897年Draus发现可与相应抗原形成沉淀反应的抗体，称为沉淀素。于是认识到毒素及细菌之外的众多蛋白质均可诱导相应抗体的生成，是一种广义的免疫现象。 直至本世纪30年代，“抗体”一词才得以通用，1939年，Tiselius和Kabat采用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动速度最慢的血清组分，称为丙种球蛋白（gammaglobulin）。免疫后的抗血清的电泳图形中，gamma球蛋白明显升高，抗血清经相应抗原吸收后再电泳，其gamma球蛋白又恢复到正常血清图形相同。在之后相当长的一段时期内，人们曾将抗体与gamma球蛋白作为同义词相互用。但事实上，具有抗体活性的球蛋白并不都泳动至gamma组分，反之在gamma组分的球蛋白并不都具有抗体活性。在1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会所属专门委员会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin），Rodney R. Porter以木瓜蛋白酶水解抗体分子，获得两个Fab和一个Fc片段，前者具有与相应抗原结合的功能，后者则具有其他生物学功能，洛克菲勒大学的Gerald M. Edelman采用来自骨髓瘤患者的均质免疫球蛋白，经过还原后证实免疫球蛋白含有两条重链及两条轻链，在此基础上Porter、Edelman及众多实验室均致力于免疫球蛋白氨基酸序列的阐明。1969年，Edelman及同事最终成功地解出了免疫蛋白的一级序列[1]，并发现免疫球蛋白由若干功能区（domain）所构成，与抗原结合的功能区具有较高的变异性，其他功能区则相对保守。 免疫球蛋白化学结构的阐明虽然为抗体的多样性(diversity)提供了物质基础，但并不能解释其形成的机制，根据推算，抗体的多样性可达108－109，一个结构基因编码一条肽链的经典概念显然与之相勃。70年代末至80年代初，日本学者利根川进(Tonegawa)用核酸分子杂交技术研究了B细胞分化发育过程中抗体基因结构的变化，阐明了免疫球蛋白的V区基因的重排与突变构成其无限组合的可能性，从而解释了抗体多样性的起源[2]。 （三）抗体产生技术 自上世纪末，以抗原免疫动物获得抗血清这一途径一直是获得抗体的经典方法。1975年Kohler及Milstein建立了B淋巴细胞杂交瘤技术，这是抗体产生的重大技术革命。该技术的普及使得众多科学家通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单隆抗体。由于单抗特异性强，性质均一，易于大量生产，在生命科学研究及医学实践方面作出了杰出的贡献，并形成产业，成为生物技术的重要支柱之一。然而，单抗多为鼠源性，采用类似的原理制备人源单抗迟迟未获进展，极大地限制了单抗作为治疗制剂在人体内的应用。为克服鼠源单抗的异源性反应，80年代中期人们开始尝试基因工程方法改造鼠源单抗，即所谓单抗的“人源化（humanized antibody）”，包括鼠Ig的V区与人Ig的C区拼接而成的嵌合抗体，或将鼠IgV区的CDR区移植到人Ig的V区拼接成的改型抗体[3]。同时，考虑到完整抗体的分子过大，不利于发挥“药物”的作用，从而采用基因工程方法使之“小型化”，如单链抗体（single chain antibody），为VH与VL直接相连，分子量仅为完整抗体的1/6。以基因操作的方式制备抗体却始于1989年底英国剑桥Winter小组与Scripps研究所Lerner小组创造性的工作，他们采用PCR方法克隆抗体全部的可变区基因（reptoire）并装于原核表达载体中，以标记抗原即可筛选到相应抗体，当时称为组合抗体库技术。90年代初期，这一技术有了进一步的发展，即将抗体基因（VH或Fd）与单链噬菌体的外壳蛋白合并表达于噬菌体表面，以固相化的抗原吸附相对应的噬菌体抗体，经多次“吹附－洗脱－扩增”即可筛选得所需抗体。这是抗体产生的又一次重大技术革命，首先该技术将抗体的基因型及表型密切连系起来，每轮操作可使特异性抗体富集102-103。噬菌体抗体库技术不仅摆脱了细胞融合等繁琐的操作，而且可不经免疫制备抗体，为制备人源抗体开辟了新途径。这一点已为实验所