吴琼基因与研究方法.pptVIP

基因及其研究方法 利用克隆、PCR、分子杂交方法 研究多元化的基因 思考 操纵子（operon）？ 操纵基因（operator）？ 调节基因（regulatory gene）？ 插入序列与间隔区 插入序列 内含子 间隔区 转录间隔区 非转录间隔区 剪切的思考－Crick1978年提出的几个问题 剪切作用若是通过酶来作用的，酶是如何识别RNA上特定位点的？ 剪切酶有没有特异性？不同RNA是否需要不同的酶？ 切除的RNA是以线状还是环状存在的？命运如何？ 内含子有无调控作用？ 编码核苷酸比实际多，Why？ 1978年，Sanger分析了ΦΧ 174中的核苷酸，5386个。 9个基因，编码2000个氨基酸。 ??? Barrell（Sanger实验室） 基因重叠的方式 包含 首尾重叠 三个基因的三重重叠 反向重叠 操纵子重叠 跳跃基因 转座子转移 原核生物的转座模型 转座带来的基因重排 转座子的遗传学效应 引起插入突变。 插入位置上出现新基因。 原来位置上保持或切离着原有的转座子。 造成插入位置上受体DNA形成正向重复序列。 调节基因活动的开关。 增加同源序列的整合。 C值矛盾 基因特性 结构基因，调控基因 操纵子，操纵基因 断裂基因，Intron，Extron 重叠基因 跳跃基因，转座子 C值矛盾 DNA分析方法与技术 我们要做什么？ 将庞大的DNA链切成小的可操作片断。 对要保存和进一步研究的DNA片断进行扩增。 证明、获取DNA片断中所需基因。 对感兴趣的片断进行表征。 限制性内切酶 常用限制性内切酶 种类及特性 限制性内切酶的剪切方式 切点出现的频率及片断大小 部分消化和完全消化 DNA限制酶分析 其它工具酶 连接酶 T4 DNA Ligase 1967 修补工具酶 DNA聚合酶I 大片断 Klenow 1971 末端加工酶 S1核酸酶 ， 碱性磷酸单脂酶 末端转移酶 人工加polyA 或polyT 尾 反转录酶 DNA扩增 DNA片断的克隆 载体: A specialized DNA sequence that can enter a living cell, signal its presence to an investigator by conferring a detectable property on the host cell, and provide a means of replication for intself and foreign DNA inserted into it. 载体的条件 ： 载体的类型 克隆载体 穿梭载体 表达载体 质粒 噬菌体 人工染色体 噬菌体载体 基因文库的建立 A collection of DNA clones that contains multiple copies of nearly every fragment in the whole genome inserted into a suitable vector and placed into storage. 重组DNA的鉴定 遗传学方法 免疫学方法 如鸡的原肌球蛋白基因的检测 肌球蛋白的免疫血清为抗体 表达产物为抗原 核酸分子杂交 Southern杂交－检测DNA Northern杂交－检测RNA 如何进行分子遗传研究？ 限制性内切酶 PCR 载体 基因文库 DNA检测的几种方法 PCR反应 a 复制起点 b 适宜的限制酶切点 c 选择标记 质粒载体 粘粒载体 酵母人工染色体 重组DNA的鉴定 重组DNA的鉴定 * 基因类别 结构基因 包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，也包括编码阻遏蛋白和激活蛋白的基因。 调控基因 包括调节基因、启动基因和操纵基因。 Operon: rDNA, tDNA…… 操纵子 J. Monod与F. Jacob 断裂基因（Splite Gene） 70年代由R. J. Roberts和P. A. Sharp首先报道。 10S? 珠蛋白前体RNA以及其15S? 珠蛋白mRNA与小鼠? 珠蛋白基因杂交形成R环的电镜图 Intron，Extron 卵清蛋白基因及其与mRNA或cDNA的杂交图 1978年，Gilbert提出内含子、外显子概念。 mRNA剪切 插入序列的生物学功能 1 在mRNA加工中改变拼接方式或途径可以增加基因片断的利用，使DNA信息储藏量增加。 2 内含子的存在可能有利于进化过程。 3 控制RNA拼接系统可以调控基因的表达。 4 内含子的相对性。 肌球蛋白轻链LC1与LC3基因 TATA TATA