动物繁殖学-华中农业大学第19讲.ppt

华中农业大学动科动医学院 第十章 繁殖新技术 第四节 克隆技术 一、胚胎分割技术 概念：同卵双生或同卵多生 意义：扩大胚胎来源；充分利用优良种公、母畜 胚胎分割所用到的仪器 广义的克隆（无性繁殖） 1．供体核的分离技术 （1）胚细胞 透明带软化 （2）体细胞 G0/G1期 （3）胚胎干细胞 G0/G1期 2．受体细胞的去核技术 （1）一步法（盲取法） 2．受体细胞的去核技术 （2）透明带切开法（两步法） 3．核卵重组技术 卵周隙注射：在显微操作仪操纵下，用去核吸管吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去除核的受体卵母细胞的卵周隙中 胞质内注射：先将供体细胞的核膜捅破，形成核胞体，再将核胞体直接注入到去核卵母细胞的细胞质中，然后进行激活处理 4．重组胚的融合技术 （1）仙台病毒法 （2）电融合法 5．核移植胚的激活、培养、移植 融合后的重组胚经化学激活或电激活后，在体外培养或经过中间受体培养至桑椹胚或囊胚，然后移入与胚龄同期的受体动物子宫角内，获得克隆后代,获得的早期胚也可作为供体核重新克隆 治疗性克隆技术 三、动物克隆技术的应用前景 作为胚胎发生、死亡及其调控，细胞核与胞质间的关系等的研究手段 为科学研究提供大量遗传性状一致的实验动物 优秀种公、母畜的纯种快速繁育扩群 拯救珍贵濒危动物，我国利用异种动物克隆技术，已克隆出了大熊猫囊胚 克隆复制转基因动物，建立生物工厂 牛胚胎移植和克隆 四、克隆技术存在的问题 　理论问题 分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚； 克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。 克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。 在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 四、克隆技术存在的问题 　实践问题 克隆动物的成功率还很低 生出的部分个体表现出生理或免疫缺限 即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象 除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。 第五节 性别鉴定与控制 在畜牧生产中， 为什么要对动物进行性别鉴定或性别控制？ 一、性别鉴定的方法 （一）细胞遗传学方法 1．核型分析法 X、Y染色体在形态上的差异。 准确率几乎是100% , 耗时太长。 一、性别鉴定的方法 （一）细胞遗传学方法 2．X-连接酶测定法 测定X染色体有关的酶的活性的高低。 短暂时期内，雌性的两条X染色体都可以被转录和翻译，雌性胚胎中与X染色体相关酶的细胞内浓度及活性是雄性胚胎的两倍。 一、性别鉴定的方法 （二）SRY基因探针法 1990 年，英国学者 Sinclair 和 Gubbay发现，哺乳动物Y 染色体短臂上靠近常染色体区的 35Kb 区域存在性别决定区， 即 SRY 基因。 一、性别鉴定的方法 荧光原位杂交 (Fish) 探针首先与报告分子（reporter molecular）结合、杂交，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接荧光染料而进行标记。 1~2枚分裂球 , 2h。 阳性，则胚胎为雄性胚胎，反之，则为雌性胚胎。 一、性别鉴定的方法 （三）PCR法性别鉴定 PCR扩增Y染色体上SRY基因的检测技术。 胚胎分割结合，几个细胞即可检测。 有条带为雄性胚胎，无条带为雌性胚胎。 二、性别控制的方法 1、精子鉴定及分离 X-精子、Y-精子（吸附、电泳） 2、个体鉴定 染色体（组型） Y-染色体（SRY 探针法） 1、流式细胞分类术分离精子 (一) 流式细胞术分离X精子和Y精子理论基础 1、流式细胞分类术分离精子 （二）流式细胞术分离X精子和Y精子工作原理 1、流式细胞分类术分离精子 （三）精确性与有效性评价 流式细胞术分离X精子和Y精子的纯度能达到90%左右。 Johnson（1989）等对分离精子对母兔宫内受精，其中用X精子受精产下的仔兔中94%是母兔，由Y精子受精产下的仔兔中81%是公兔。 1、流式细胞分类术分离精子 （三）精确性与有效性评价 Johnson（1991）等又对猪做同样的处理，结果分别产下了74%的雌性和68%的雄性仔猪。 Cran（1993）和Seidel（1997）等报道，用分离的Y精子进行人工受精（AI）或体外受精（IVF）和胚胎移植（ET）后产下的67头犊牛中，90%为公犊牛，用分离的X精子做相同的处理后产下139头犊牛，其中83%为母犊牛。 三、流式细胞分类术分离精子 （四）优缺点 准确性高 分离速度慢 仪器昂贵，成本高 1、概念 转基因技术就是用实验室方法将所需要的目的基因导入