新课件-单克隆抗体.ppt

多采用抗体分子片段,如Fab，Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。 基因工程BsAb 定义： 将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性 （五）噬菌体抗体库技术 用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面 用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。 使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。 抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人 （一）基本原理和程序 噬菌体抗体库 从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； 应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段； 构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体； 表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。 构建噬菌体抗体库 模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性 （二）噬菌体抗体库技术的特点 避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 可获得高亲和力的人源化抗体 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体 * * * 特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞 有限稀释法 每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。 效率最高 价格昂贵 FACS 软琼脂平板法(soft agar method) 37℃、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。 吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。 配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮?保存数年至数十年 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏 杂交瘤细胞的冻存与复苏 在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故 防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡 细胞冷冻的意义 （1）单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。 A、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-56； B 、单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定 免疫扩散 ELISA C、单抗纯度的鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫 转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS、IEF、WB （三）单克隆抗体的性质鉴定 （2）单抗理化特性的鉴定 抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。 常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA 、间接ELISA、间接法夹心ELISA等 （3）单抗与相应抗原的反应性测定 包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等 三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减