植物细胞悬浮培养技术幻灯片.ppt

操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2～4细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。 2.2.2 连续培养（Continuous culture） 加入培养基 排出培养基及其培养物 二者体积相等 分：开放式连续培养 封闭式连续培养 开放式和封闭式区别 封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加； 开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出 。 连续培养意义： 1.植物细胞代谢调节的研究 2.某种生长限制因子对细胞生长的影响 3.次生产物的大量生产 紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。红豆杉树皮中紫杉醇的含量为万分之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg 3 由悬浮细胞再生植株的途径 由悬浮细胞直接形成体细胞胚 先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株 3.1 悬浮培养对培养基的要求 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养基，一般也适用于建立该物种的悬浮培养。 在活跃生长的悬浮培养物中，无机磷酸盐的消耗很快，不久成为限制因子。要及时继代。 Noguchi等(1977)证明，把烟草悬浮培养物保存在一种含有标准的MS无机盐培养基中，培养开始3d之内无机磷酸盐的浓度就几乎下降为零，即使把培养基中磷酸盐的浓度提高到原来的水平的3倍，5d之内也会被细胞全部用完。 高等植物的悬浮培养，B5和ER培养基。 3.2 条件培养基 把在液体培养基里 培养4～6周的高浓度细胞滤掉，而用他的培养基制成悬滴或薄层来培养单细胞或低密度细胞群体。 3.3 培养基的振荡的意义 防治细胞缺氧死亡 防治大的细胞团的形成 4 悬浮培养细胞的同步化 同步培养： 指在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。 应用：为了便于研究细胞分裂和细胞代谢 4.1 物理方法 A 按细胞团的大小 通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）的控制，以实现高度的同步化 B 低温休克法 通过对生长环境条件（光照、温度等）的控制，以实现 高度的同步化 4.2 化学方法 A 饥饿法 先对细胞断绝一种细胞分裂所必须的营养物质成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。 细胞周期（cell cycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。 间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。 细胞分裂期：前期，中期，后期，末期 B 抑制法 使用DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶、羟基尿和胸腺嘧啶脱氧核苷 当细胞受到化学药物抑制时，细胞周期只能进行到G1，细胞滞留在G1期S期的边界上。 5 悬浮培养中细胞生长量的计算 细胞计数 细胞密实体积（PCV） 5％铬酸或0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散 用血球计数板进行。 将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，3000rpm离心，用每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。 细胞鲜重 细胞干重 细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽滤，称重。 细胞干重：60℃干燥12h，称重。 以每毫升培养物或106个细胞的重量表示。 6.培养细胞活力的测定 相差显微术法 TTC法（2,3,5-氯化三苯基四氮唑） FDA法（荧光素双醋酸酯法） 伊凡蓝法(Evan’s blue)（FDA的互补法） 根据细胞质环流和细胞核存在与否，鉴别细胞的死活。环流正常、核存在表明有活力； 在活细胞中，TTC被还原成红色甲鐟，提取甲鐟用分光光度计检测。 活力受损的细胞能够摄取这种染料，完整的活细胞则不能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞。 FDA法的原理 FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。 FDA 荧光素 活细胞 死细胞 步骤： 活细胞 死细胞 FDA先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为0.01% 思考题： 如何得到植物离体单细胞？ 植物细