原位杂交双语.ppt

In situ hybridization desigen by  Eric wang 一、概念 应用已知碱基序列并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。 IN SITU HYBRIDIZATION is an imaging method to visualize mRNA expression in tissues and cells.? A fluorophore-labeled mRNA probe that has consensus sequence to mRNA you are interested in, will be hybridized to the fixed tissues or cells.? The resultant fluorescence will be detected an imaged with a microscope.? Overall procedures include:1. Synthesis (expression) of mRNA probe2. Fluorescence labeling of the mRNA probe3. Fixation and hybridization of the specimen4. Mounting of the specimen and microscopic imaging. 二、目的 研究单一细胞中DNA定位 研究单一细胞中mRNA定位 三、应用领域 基础研究：1、基因组图 2、基因表达定位 3、mRNA的排列和运输 临床研究：1、细胞遗传学 2、产前诊断 3、肿瘤和遗传性疾病的诊断 4、生物学剂量检测 5、病毒学和病原学诊断 四、原理 五、基本方法概述 （一）杂交前准备： A：固定 目的是保持细胞形态和最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平，使探针易于进入细胞或组织！ 注意事项： RNA容易被酶降解，为使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。 固定剂： ①多聚甲醛 ②醋酸－酒精混合液 ③取材后直接液氮冷冻，切片后才将其浸 入4％多聚甲醛10min，空气干燥后保存在 -70℃ B：玻片的处理（包括盖玻片和载玻片） 热肥皂水刷洗 自来水清洗 置于清洁液中浸泡24hr 清水洗净、烘干 95％酒精浸泡24hr后蒸馏水洗净、烘干 150℃或以上烘干至少8hr 硅化处理 粘附剂预涂 C：组织的处理 方法：①稀释的酸 ②去垢剂或清洗剂Trixon X－100 ③Protein K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 D：减低背景染色 多聚甲醛固定后浸入酸酐和三乙醇胺中，可以减低静电效应。 杂交后的酶处理和洗涤均有助于减低背景染色。 将组织切片进入预杂交液中可以达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。 E：防止RNA酶污染 整个杂交前处理过程都需要戴消毒手套。 所有实验用玻璃器皿剂镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。 （二）杂交 滴加杂交液 加盖硅化的盖玻片 放入盛有少量5×SSC溶液的 湿盒中进行孵育 (三) 杂交后处理 post hybridization treatment 包括系列不同浓度、不同温度的盐溶液的漂洗。 一般遵循的漂洗原则是：盐溶液浓度由高到低、温度由低到高 目的：减低背景染色。 (四)显示 visualizatio