外源基因在宿主细胞中的表达2.doc

外源基因在宿主细胞中的高效表达- II 表达系统与表达策略 基因的表达系统 大肠杆菌 基因在酵母中的高效表达 基因在昆虫细胞中的表达—杆状病毒表达系统 根据表达蛋白的用途选择基因的表达策略 (以利用大肠杆菌进行基因表达为例) 生物化学与分子生物学研究 着重考虑的问题是：如何保持蛋白质的原有功能不变 表达策略：直接表达天然蛋白（尽量可溶） 表达融合蛋白最好带有特异性酶切位点，可以将天然蛋白切下来） 表达蛋白用作抗原 获得包涵体 获得融合蛋白（如：带His6标签） 结构研究 要求：蛋白质必须是以可溶形式表达的 基因在大肠杆菌中的高效表达 (1)表达系统 (2)融合表达 (3)分泌型表达 (4)包涵体形式表达与蛋白质复性 (1)表达系统（大肠杆菌pET表达系统为例） 载体 受体菌 载体. 例：pET-28 主要构成元件： T7噬菌体启动子 T7噬菌体终止子 核糖体结合位点 His6标签序列 凝血酶切割位点 多克隆位点 乳糖操纵子和 乳糖阻遏子序列( lac I） pBR322复制子 f1噬菌体复制子 卡那霉素抗性基因 乳糖操纵子和乳糖阻遏子序列的作用： 当目的蛋白对大肠杆菌有毒性时，可以通过添加阻遏物，控制目的蛋白以较低水平表达 His6标签序列、凝血酶切割位点的作用 受体菌 如：pET表达系统的受体菌：BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS BL21菌株缺失lon和ompT蛋白酶，使目的蛋白更加稳定，提高表达量 DE3菌株的基因组上携带T7RNA聚合酶基因（溶原形式） T7RNA聚合酶的优势： T7RNA聚合酶合成RNA的速度快，效率高 （速度高于大肠杆菌5倍；合成的基因产物占蛋白总量的25%以上） T7RNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠杆菌序列的转录 （能充分表达T7下的基因） T7RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素（利福平等）有抗性 （实现基因的有效表达） （DE3）pLysS菌株能够产生T7RNA聚合酶的抑制剂—T7溶菌酶，其作用： （1）使目的基因的表达处于严谨的控制之下 （2）由于T7溶菌酶的破细胞壁的作用，在纯化蛋白质时容易使细胞破碎 方法过程实例 ： 重组质粒构建→转化大肠杆菌→BL21(DE3)菌株→转化物涂布于带有Amp抗性的平板→阳性菌落筛选→质粒提取→质粒电泳→进一步质粒酶切确认→选择正确克隆,进行诱导表达(加入诱导物IPTG) →SDS电泳→ 考马斯亮蓝染色观察→电泳结果→Western印迹法鉴定所诱导的蛋白 融合表达 担体蛋白+外源蛋白→融合蛋白 例： 分泌型表达 重组蛋白在大肠杆菌中有4种定位: 细胞质 细胞内膜 细胞外膜 细胞外培养基 分泌型表达的好处: 便于简化发酵后处理工艺 有利于蛋白质正确构象的形成 减少降解的机会，提高蛋白质的回收率 如何实现分泌型表达？ 信号肽介导的分泌表达 信号肽通常由15-30个疏水氨基酸组成，信号肽的疏水肽段能形成α螺旋结构，临近切割位点的氨基酸倾向于形成β折叠，这可能是信号肽酶所识别的结构。 包涵体形式表达与蛋白质复性 包涵体形式的原因(蛋白质的错误折叠) 如何防止包含体形成？ 分子伴侣、折叠酶以及其它折叠调制蛋白的应用 通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性（如温度、营养） 通过同其它蛋白、蛋白片段或者短肽形成融合蛋白，改善重组蛋白产物的可溶性 通过分泌表达，获得可溶性的重组蛋白 通过基因突变技术，在蛋白质分子中产生氨基酸取代，来增加重组蛋白的可溶性（前提：不能改变蛋白的活性） 新生肽链的折叠需要两种外来蛋白因子的参与：分子伴侣和折叠酶 分子伴侣—通过保护暴露到溶剂中的蛋白质的疏水表面，以及通过一种可控的方式释放出被其结合的多肽链，从而促进多肽链正确地折叠 折叠酶其作用是加快折叠过程中特异性的步骤，如二硫键的正确配对、形成以及蛋白质分子的异构化作用 包含体的分离方法(图解见课件) 长期以来，人们用大肠杆菌作为表达系统表达了多种蛋白，但是这一系统存在一些缺陷： （1）缺少真核生物的蛋白翻译后加工修饰，如：剪切、糖基化、形成二硫键等 （2）表达的蛋白常以包涵体的形式存在 基因在酵母中的高效表达 酵母是一类单细胞的真核生物 作为真核生物，酵母有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达调控机制 作为一种微生物，它具有生长繁殖迅速、营养要求简单和便于工业化大规模发酵培养的优点 1996年完成全基因组测序（第一个完成全基因组测序的真核生物） 1981年，Hitzman等用酵母表达系统表达了人α