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实验七 酶联免疫吸附试验（ELISA） 赵钦 qinzhao_2004@nwsuaf.edu.cn兽医免疫生物学实验室 动物重大疫病致病机制研究团队 （猪蓝耳病，动物HEV人畜共患病） 酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：以免疫学为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合。 抗原抗体反应的特点： 特异性（钥匙和锁） 适当比例（分子比例合适出现最强反应） 可逆性（遵循生物大分子热动力学反应原则） 一 原理： 1. 抗原或抗体能以物理作用吸附于固相载体表面 蛋白质与聚苯乙烯（疏水基团） 2. 抗原或抗体可以通过共价键与酶连接形成酶结合物 3. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可以根据加入底物的颜色来判定是否发生免疫反应。 二、方法种类 可用于测定抗体又可用于测定抗原 （一）测定抗原，主要有四种 1. 竞争法 2. 双抗体夹心法 3. 改良双抗体夹心法 加特异性的抗体（没有酶标记） 加入酶标二抗 4. 抑制性测定法 （二）测定抗体 间接ELISA法： 三、ELISA的影响因素 （一）固相载体 聚苯乙烯，吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。 （二）抗原 纯度高， （三）试验样品 血清，血浆和其他体液 （四）结合物 酶标记的抗体：AP,HRP （五）洗涤剂与稀释剂 吐温-20 （六）底物 OPD, TMB, ABTS （七）显色时间 确定显色时间的两种方法 ELISA摸索5个条件： （1）抗原包被浓度 （2）被检血清稀释度 （3）第一抗体作用时间 （4）酶结合物作用时间 （5）底物作用时间 （八）结果判定 肉眼观察颜色变化；分光光度计做精确测定 （九）试验的重复性 变异系数（板间和板内） （十）对使用仪器的要求 清洁，试剂标准化 四、试剂与器材 包被缓冲液——碳酸盐缓冲液（pH9.6） 洗涤缓冲液——含0.05%的吐温-20的PBST 封闭液——含BSA的PBST 稀释液——1%BSA PBST 底物溶液——柠檬酸缓冲液，TMB, 30%H2O2 终止液——3M H2SO4