实验二十三 凝胶层析分离血红蛋白和核黄素.docVIP

实验二十三 凝胶层析分离血红蛋白和核黄素 【目的】 1. 掌握凝胶层析的基本原理。 2.熟悉凝胶层析的操作过程。 【原理】 凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。这样就可达到分离核黄素和血红蛋白的目的。收集洗脱液后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘制洗脱曲线。 【器材】 分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶 、刻度吸管 、量筒、试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸 、铅笔 、玻璃棉或海绵垫。 【试剂】 1．葡聚糖凝胶SephadexG-25 或SephadexG-50 2．核黄素饱和水溶液 3．生理盐水 4．甲苯 5．血红蛋白溶液 取抗凝血2ml置离心管中，2000r/min离心10min，使血细胞沉淀，弃去血浆及白细胞层。向红细胞沉淀加入生理盐水4ml，振摇洗涤，2000r/min离心10min，弃去上清液，共洗涤三次。向沉淀加入蒸馏水2ml，混匀，再加入甲苯1 ml，猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。2000r/min离心10min，取上清血红蛋白溶液备用。 6．0．1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2） 取0．1mol/L磷酸氢二钠720ml和0．1mol/L磷酸二氢钠280ml,混匀。 【操作】 1.凝胶准备 称取SephadexG-25 5g或SephadexG-50 3g,加磷酸盐缓冲液50ml，置于水中浸泡6小时（沸水浴中溶胀2小时），用磷酸盐缓冲液漂洗，去除漂浮的细小颗粒。 2.装柱 取直径0.8～