单克隆抗体的制备及应用-2010.ppt

单克隆抗体的制备;一、概论;抗原;;;定义：由一个B淋巴细胞通过有丝分裂繁殖形成的细胞群称为“克隆”。针对一个抗原决定簇，由这一个克隆系产生的抗体称为单克隆抗体 特点：特异性强、性质均一、易于大量生产 ;1975年，英国人Kohler和Milstein 建立了B淋巴细胞杂交技术，并于1984年获得诺贝尔奖 融合技术发展 融合方法 融合细胞品系 80年代后期瓶颈 ： HAMA反应（Human anti Mouse Antibody） ;随着分子生物学发展，单抗技术有了新的突破 嵌合抗体 改型抗体 人源化抗体 转人基因小鼠;杂交瘤系统 小鼠杂交瘤系统 大鼠杂交瘤系统 兔杂交瘤系统 人杂交瘤系统 人脾细胞/淋巴细胞×鼠骨髓瘤细胞 人脾细胞/淋巴细胞×人骨髓瘤细胞;三、单克隆抗体的制备;融合前的准备;小鼠的标记 染色法（常用） 3.5%－5%的苦味酸溶液 先左后右，从前到后 双色：双位数 打孔法 戴环法 ;免疫小鼠 一般选择健康8-12周龄的雌性BALB/C小鼠：融合用骨髓瘤细胞多来自此品系小鼠 常用的免疫途径： 腹腔注射：完全福氏佐剂---初次 不完全福氏佐剂---加强 静脉注射 脾内包埋、注射：抗原少、快速、高效 ;3. 一般要经过初次免疫、加强免疫、冲击免疫三个过程 4. 免疫前取血作阴性对照，加强免疫时取血检测特异性抗体的产生和效价，决定冲击免疫和融合时机;免疫流程 每只小鼠100μg抗原与完全福氏佐剂等量混匀，腹腔注射 2~4周后，同量抗原加不完全福氏佐剂追加免疫一次（检测抗体效价，必要时重复步骤2） 同量抗原不加佐剂静脉冲击免疫一次 冲击免疫后3~4天获取小鼠脾细胞;亲本细胞的选择;细胞准备 复苏小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞，培养至细胞对数生长期;融合;收集骨髓瘤细胞（1500rpm,5min）;无血清培养基分别冲洗脾细胞和骨髓瘤细胞各三遍 细胞计数： 脾细胞/骨髓瘤细胞=2-10/1;融合：均在37℃水浴中进行，加入融合剂时需连续搅拌 1min：0.7ml PEG加入混合细胞中 2min：继续搅拌 3min：1ml无血清培养液 4min：3ml无血清培养液 5-8min：加至30ml 离心：800-1000rpm,5min 加入HAT选择培养基 铺板 ; 注意事项 1. PEG： MW 1000~4000 浓度 30%~50% 作用时间 2. 培养液缓缓加入：渗透压改变 3. 加入和倾倒PEG时均需彻底;融合细胞的选择原理;A. HAT选择培养基 1964年Littlefield首先发明了HAT（H—Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T——Thymidine 胸腺嘧啶核苷）培养基的选择培养 HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的 ;细胞内DNA的生物合成途径;小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0） 融合后的细胞在HAT选择培养基中结局 ;B. 荧光流式细胞仪分选（FACS法） 两种颜色荧光素分别标记两种融合细胞 异硫氰酸荧光素（FITC） 罗丹明 筛选同时有两种荧光素的融合细胞 所筛细胞直接接种96孔板 ;融合后的管理;检测 一个高倍视野大小 检测上清 间接法 筛选阳性孔入24孔板扩增 ;亚克隆 软琼脂克隆法 有限稀释法(常用) ：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞 ;;亚克隆细胞的培养 添加饲养细胞：胸腺细胞 提高血清浓度：20% 添加细胞因子：IL-6，胰岛素;多次亚克隆（2-3次） 确保每个孔中只有来自于一个细胞的克隆群 淘汰核型不稳定的克隆，获得稳定基因型和稳定分泌抗体的克隆;扩增培养、冻存细胞;四、单克隆抗体的大量获得与纯化;体外培养 培养上清中的牛血清影响纯化效果 逐步降低培养基中血清浓度 20%-10%-5%-2.5%-1%-0 把握时机 专用无血清培养基 生物反应器（Bioreactor） ;体内培养 小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞，诱导含有大量单克隆抗体的腹水 将对数生长期杂交瘤细胞洗涤后重悬于无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液中注射 接种前一周需用降植烷处理小鼠腹腔，抑制腹腔免疫系统，有益于杂交瘤接种 抗体效价高，但可能被小鼠自身抗体污染 ;实 验 内 容;腹腔注射 小鼠眼眶取血 处死小鼠 原代细胞的分离、培养;腹腔注射： ①用左手拇指