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免疫组化原理及流程介绍 实验分析的相关介绍 阳性对照： 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。 阴性对照： 免疫组化原理及流程介绍 阳性对照 阴性对照 替代对照 实验 组 结论 1 － － － － 操作错误 2 ＋ ＋ ＋ ＋ 非特异性反应 3 ＋ ＋ － － 阴性对照含定位Ag 4 － － － ＋ 阴性对照不含定位Ag 5 ＋ － ＋ ＋ 受检组织非特异性染色 6 ＋ － － － 受检组织不含定位Ag 7 ＋ － － ＋ 受检组织含定位Ag 免疫组化染色实验组与对照组结果分析表 组化染色的原理及流程介绍 主要内容 免疫组化原理及流程介绍 一.常规组织化学染色 二.免疫组织化学染色 三.免疫荧光染色 四.免疫组化的结果分析 免疫组化原理及流程介绍 一.发展简史 1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。 免疫组化原理及流程介绍 二 免疫组化的原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。 三 免疫组化的基本流程 免疫组化原理及流程介绍 1.脱蜡与水化 2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.抗原修复、暴露抗原决定簇 4.封闭非特异性蛋白 5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反应 8.显色 9.复染、脱水、透明、封片 2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 免疫组化原理及流程介绍 1.脱蜡与水化 脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。  60 ℃×20 min→Xylene：2 ×10 minutes； 100% absolute ethanol： 2 ×5 minutes； 95% ethanol 2 minutes； 80% ethanol 2 minutes； 70% ethanol 2 minutes； distilled water:5 min； PBS 洗 3 ×3 min。 具体操作 免疫组化原理及流程介绍 2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。 (1)细胞通透 免疫组化原理及流程介绍 (2)封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。 1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。 免疫组化原理及流程介绍 具体操作: 免疫组化原理及流程介绍 3. 抗原修复 暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。 免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。 抗原修复的主要方法: 酶消化方法一般用于细胞内抗原 应用高频电磁波打开蛋白质间的交联键 免疫组化原理及流程介绍 将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约4次，每次间隔补足液体，防止干片。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。 具体操作（微波修复）： 1) 免疫组化原理及流程介绍