电镜标本处理课件.pptVIP

免疫染色后的标本处理 Prof. 李瑞锡 PH.D. 复旦大学上海医学院解剖 与组织胚胎学系 2009.12.1 免疫电镜技术 是用电子显微镜观察免疫标记细胞和组织超微结构的技术 是在免疫细胞化学技术和电镜技术的矛盾结合点上形成的新方法。 Protocol for immunohistochemistry 免疫组织化学技术与电镜技术的矛盾点: 免疫组织化学: 破坏细胞膜增强抗体的穿透性, 最大限度地标记抗原！ 电镜技术：最大限度地固定保存细胞的膜性结构，使细胞超微结构清晰美观。 两者的矛盾结合点： 既良好地标记了抗原又完美地保留了膜性结构 免疫电镜技术的基本流程 从动物到电镜照片 组织固定、取材 切片（40微米) 免疫组化染色 锇酸固定 脱水 树脂包埋聚合 超薄切片 电子染色 电镜观察照相 Photo shop处理照片 论文照片版面做成 光镜 电镜 振动切片机 40 um 免疫染色 树脂包埋 脑（for example) vibrating-blade microtome切片 超薄切片60-80 nm、电子染色（醋酸铀/枸橼酸铅） 电镜观察照相 锇酸固定 ultramicrotome 8 将切片裱于蛋清涂布的载玻片上，充分晾干。入0.1 mol/L PB。漂洗5 min×3次。 9 在湿盒和通风厨中，每张切片加于2%锇酸60～80 μl。固定1.5～2h。漂洗5 min×4次。 10 经50%、70%、80%、90%、100%（3次）各级酒精脱水，每级10 min。 11 在切片表面注入少量Epon/丙酮液（Epon：丙酮 = 2：1），用注满Epon液的塑料胶囊扣入切片上。 12 置聚合箱中，37℃聚合24h，60℃聚合48h。 13 在酒精灯外燃上加热5～7秒，将标本从载片上分离，剥除塑料胶囊。镜下选择超薄切片部位或细胞。 14 修块，用超薄切片机切片，片厚60～80 nm。将切片裱于铜网。 15 醋酸铀、枸橼酸铅染色，双蒸水洗净，电镜观察。 染色后标本处理的基本步骤 锇酸固定 锇酸的配制与管理：用0.1M PB配制，浓度为2%。用棕色磨口瓶密封，4度冰箱内保存。 固定时间：1.5～2h 注意事项：在通风橱中进行。 脱水 经50%、70%、80%、90%、100%（3次）各级酒精脱水，每级10 min 包埋Epon树脂的配置 器具：50～100ml塑料水杯或相应大小的烧杯；5～10 ml塑料注射器；1 ml注射器；医用手套；Epon套剂（4种）。Epon配方与配量： Epon DDSA MNA DMP-30 Total（ml） 23.8 16.0 11.5 0.8 52.1 11.9 0.8 5.75 0.4 26.05配制：根据上配方，用注射器取Epon加入杯中，置搅拌器上用磁棒旋转搅拌，依次加入DDSA，NMA，最后加入DMP-30，用膜封住杯口免湿气侵入，继续搅拌30min。 树脂包埋 聚合：聚合箱内37℃ 24h，60℃ 48h 取块与修块 超薄切片 切片刀 载片铜网 电子染色：醋酸铀/枸橼酸铅 电镜观察