血清白蛋白的分离纯化及鉴定(一)-盐析、G-25脱盐、G-75层析.pptVIP

血清白蛋白分离与纯化 实验目的 1.了解血清蛋白质分离的一般方法 2.掌握盐析法、凝胶层析分离纯化白蛋白的方法 实验原理 血清中主要蛋白：白蛋白与球蛋白 正常人血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白的量保持相对恒定；总蛋白60-80克/升，白蛋白为40-50克/升，球蛋白为20-30克/升。 盐析法 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电子层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。 利用白蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。血清白蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀析出，血清球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀析出。 凝胶层析 1、凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术，是一种分子筛效应。 2、当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。 凝胶类型 分离范围（Mr） 应用 G-25 1000-5000 去盐 G-75 3000-70000 中等蛋白质分离 不同类型的葡聚糖凝胶的分离范围和应用 实验步骤-硫酸铵盐析 取正常人血清2.0ml于小试管中，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液2.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000r／min离心10min。 用滴管小心吸出上层清液于另一试管中，作为纯化白蛋白之用。 凝胶柱G-25层析除盐 1、装柱：洗净的层析柱垂直夹于铁架上（有尼龙网孔的一头朝下），将底部夹紧，注入约2.0 ml的0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液。将G-25疑胶搅成悬浮状加入层析柱内，慢慢打开柱底部出口，同时，不断加入凝胶直至柱高25cm（装柱时速度要均匀，不能分层，不得有气泡，凝胶床表面要平整）。 2、平衡：在凝胶柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱底部旋紧，用0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡20min，(防止柱床流干)。 凝胶柱G-25层析除盐 3、洗脱：凝胶柱经0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后，慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐（不低于凝胶床面），夹死底口。用吸管吸取样品Ⅱ，小心缓慢的加到凝胶床面，打开底口，使样品Ⅱ慢慢进入凝胶床面直至与床面相齐。吸取缓冲液，沿壁慢慢加入凝胶床面，进行洗脱。 4、收集：洗脱液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml，用紫外检测仪检测蛋白峰并收集，为样品Ⅲ，绘制洗脱曲线。 凝胶柱G-75分离纯化 1、装柱：洗净的层析柱垂直夹于铁架上（有尼龙网孔的一头朝下），将底部夹紧，注入约2.0 ml的0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液。将G-75疑胶搅成悬浮状加入层析柱内，慢慢打开柱底部出口，同时，不断加入凝胶直至柱高25cm（装柱时速度要均匀，不能分层，不得有气泡，凝胶床表面要平整）。 2、平衡：在凝胶柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱底部旋紧，用0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡20min，(防止柱床流干)。 凝胶柱G-75分离纯化 3、洗脱：凝胶柱经0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后，慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐（不低于凝胶床面），夹死底口。用吸管吸取样品Ⅲ，小心缓慢的加到凝胶床面，打开底口，使样品Ⅲ慢慢进入凝胶床面直至与床面相齐。吸取缓冲液，沿壁慢慢加入凝胶床面，进行洗脱。 4、收集：洗脱液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml，用紫外检测仪检测蛋白峰并收集，为样品Ⅳ，绘制洗脱曲线。