优良菌种选育(原生质体融合).ppt

选育高产优质菌株 酿酒酵母——葡萄糖→酿酒 糖化酵母——淀粉和糊精→葡萄糖 ↓原生质体融合 融合子——淀粉和糊精→葡萄糖→酿酒 选育高产优质菌株 地衣芽孢杆菌——蛋白酶，容易被噬菌体感染 抗噬菌体菌株——抗噬菌体 ↓原生质体融合 融合子——蛋白酶+抗噬菌体 产生新的产物 代谢途径融合，方向改变 庆丰霉素产生菌 井冈霉素产生菌 ↓ 融合子 聚醚类抗生素+环状多肽类 1．多细胞菌体的单细胞化作用2．真菌双核体单核化作用3．菌体脱壁再生优良菌株原生质体4．原生质体转化 《原生质的其他用途》 1．多细胞菌体的单细胞化作用 许多真菌营养体是多细胞的，当进行诱变处理时，首先应进行单细胞化，采用脱壁形成的原生质体，可以用于诱变处理。 2．真菌双核体单核化作用 许多高等单子菌的次生菌丝是双核体，通过原生质体释放再生过程可以单核化，可以用于诱变处理。 脱壁再生的菌株具有很大的差异性，从生长速度、代谢活性上面都表现出差异，通过原生质体释放再生出来的某些菌种可提高产量。原因 1.突变率提高 2.对菌体细胞刺激作用 3 菌体脱壁再生筛选优良菌株 原生质体更易吸收外源DNA完成转化过程，原生质体作为“感受态”细胞与待转化DNA混合在一定浓度CaCl2作用下进行转化。 4 原生质体转化 1970 用硝酸钠诱导植物原生质体融合 1972 用硝酸钠进行了烟草种间原生质体融合 1972 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 1974 发现PEG是一种良好的融合剂用于原生质体融合 1976 以曲霉，青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 1976 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 1977 链霉菌原生质融合并获融合重组子 1978 用PEG + 高pH-Ca2+研究原生质体融合 1981 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量PEG获得较高的融合率 1988 原生质体融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株PEG 原生质体研究的发展 受限制小，没有供体受体之分，有利于不同种属 重组频率高，放线菌10-2～10-1，真菌10-3～10-2，细菌10-6～10-5 遗传物质传递更充分 可先用理化因子处理（温度，药物，紫外线），诱变率更高。 总结原生质体融合育种 * * * * * * 分泌物质是添加甘氨酸，图细胞膜破裂 等渗溶液 * 在等渗溶液中的酶活性 * * 可能性 A-B+， A+B-，A+B+ * zhu4 * 白蛋白，在人体内它最重要的作用是维持胶体渗透压。明胶，蛋白质的混合物 * * * * * * 原生质体融合 自然突变选育：几率低 诱变选育 ：缺陷性，可获得大量突变株 杂交育种：也可获得多数重组子，须亲和性 原生质体融合：融合子，个数少 基因工程技术：定向培养 优良菌种选育——要点 原生质体 (Protoplast) 大多数微生物细胞具有细胞壁。采用一定技术去掉细胞壁，剩下的细胞部分称之为原生质体。 任何形状的细胞去掉细胞壁后都呈球形。 原生质体融合 从动植物细胞的研究发展起来，然后应用于真菌，放线菌，细菌 微生物有性重组局限性大，自然杂交现象少 借助原生质体融合技术实现遗传物质的交换 原生质体融合的优越性 打破属种的界限，扩大重组范围。 受限制小，没有供体受体之分，有利于不同种属 重组频率高，放线菌10-2～10-1，真菌10-3～10-2，细菌10-6～10-5 遗传物质传递更充分 应用于诱变：原生质体对理化因子敏感（温度，药物，紫外线），诱变率更高。 原生质体制备 原生质体纯化 原生质体融合 融合子检出 融合子鉴定 原生质体融合步骤 超声波处理菌体释放原生质体 酶解细胞壁释放原生质体 微生物原生质体制备 原生质体制备（酶法） 微生物细胞壁组成不同，须采用不同的方法 革兰氏阳性菌：甘氨酸，适当青霉素添加培养，溶菌酶（Lysozyme） 革兰氏阴性菌：溶菌酶 常用酶：溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶， 在等渗溶液中制备，防止细胞破裂 种类 纤维素 几丁质 其它多糖 疫霉属 25 0 65 毛霉属 0 9 44 酵母属 0 1 60 镰刀菌属 0 39 29 裂褶菌属 0 5 81 鬼伞属 0 33 50 真菌的细胞壁成分 几丁质酶 Chitinase 纤维素酶 Cellulase酵母裂解酶 Zymolyase β1,3葡聚糖酶蜗牛酶商品酶 Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶  Gluc