同步荧光法.docx

同步荧光法测定维生素B1，B2，B6含量的条件研究陆栋，何姗姗（浙江大学药学院）摘要：本文研究了同步荧光法同时测定药物中维生素B1，B2，B6的测定条件。以⊿λ=25nm进行同步扫描所得到的三个同步荧光峰（以发射波长表示，分别位于412nm，509nm，379nm）可以同时分别测定维生素B1，B2，B6。方法快速，灵敏。在最佳实验条件下，维生素B1，B2，B6的工作曲线线性范围分别为0.5~4ug/ml，0.25~2ug/ml，0.04~0.3ug/ml。关键字：同步荧光法，维生素B1，维生素B2，维生素B6维生素B2，B6本身为荧光物质，维生素B1在碱性介质中发生硫色素反应生成硫胺荧后也可产生强荧光，三者常共存于同一样品中，所以三者的同时测定一直是荧光分析领域所探讨的课题。荧光技术尽管灵敏度高，但对一些复杂混合物，比如维生素B1，B2，B6混合样品，其分析常遇到光谱互相重叠，不易分辨的困难，需要预分离后逐个分别测定，步骤繁琐。本文利用同步荧光法使其三者的光谱简化，普带变窄，提高选择性，减少光散射干扰等特点，得到了可以同时测定三者的同步荧光光谱，并考察了在最佳实验条件下的线性范围，建立了一个快速，简便的荧光分析步骤。实验部分1.仪器和试药JASCO FP-6500荧光光谱仪，BOLONG USC-302超声仪，TELTA320 pH计，维生素B1，维生素B2，维生素B6：生化试剂，均为浙江大学药学院药物分析实验中心提供。复合维生素B片：含维生素B1 3mg/片，维生素B2 1.5mg/片，维生素B6 0.2mg/片，批号维生素B1（盐酸硫胺素）标准液：准确称取100mg硫胺素，用水定容至100ml，浓度为1mg/ml（溶液在棕色瓶中于5℃冷藏）。放在棕色瓶中冷藏备用维生素B2(核黄素) 标准液：准确称取50mg核黄素溶解于稀盐酸溶液中并定容至500ml，浓度为100ug/ml。放在棕色瓶中冷藏备用维生素B6（吡多辛）标准液：准确称取50mg维生素B6，用水定容至500ml，浓度为100ug/ml的贮备液，放在棕色瓶中冷藏备用1%铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾溶液0.1g，用水稀释至10ml15%氢氧化钠溶液：称取7.5g氢氧化钠，定容至50ml。磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液：将0.2M磷酸氢二钾溶液与0.1M柠檬酸溶液按体积比6:1混合，用柠檬酸溶液调节至pH=7.0 （Na2HPO4?：174.14；?柠檬酸：192.14）2.实验方法取维生素B待测液适量于50毫升容量瓶中，加入缓冲液至10毫升，加入1毫升15%氢氧化钠溶液和0.5毫升1%铁氰化钾溶液，摇匀，置于暗处1小时，摇动下加入稀硫酸至中性（用酚酞指示）。用缓冲液定容至刻度，摇匀。于下列仪器条件下进行荧光扫描及测定。：BANDPASSEx：10nm EM ：10nm ，SCAN SPEED：200nm／min，PM (能量增益)：low，RE—SPONSE：2s，BOTH SCAN：SET。从同步扫描确定波长差⊿λ=25nm，V B1 387nm／412nm，VB2 484nm／ 509nm，VB6 354／379nm，为最佳测定波长。测得同步荧光值，由各自工作曲线计算其含量。结果与讨论1.光谱扫描VB6VB1VB2取维生素B标准液各1ml分别置于10ml容量瓶中，按实验方法处理。于λeλ300—600nm进行扫描，测绘各自的激发光谱和发射光谱（图1）。维生素B1， B6的荧光激发峰分别位于373nm和326nm，维生素B2的荧光激发峰有337nm，403nm，493nm（最强）三个。维生素B1，B2，VB6B6的荧光发射峰分别位于443nm，531nm，392nm。VB1VB2 图1 维生素B1，B2，B6激发光谱（上）和发射光谱（下）2.波长差⊿λ选择各取维生素B1，B2，B6 0.5ml，2ml，10ml于50ml容量瓶中，按实验方法处理后，选择不同⊿λ值（⊿λ=10,20,25,30,40,50,60nm）扫描得其同步荧光光谱（图2）。结果表明随着⊿λ的增大，荧光信号也随之增大，但分离效果变差，综合分离效果和荧光信号强度两个条件，本实验选择⊿λ=25，如图3所示，此时三者明显分开，而且灵敏度较好。图2 波长差⊿λ对同步荧光光谱的影响 10nm 20nm 25nm 30nm 40nm 50nm 60nmB2B1B6图3 维生素B1、B2和B6的同步荧光光谱（⊿λ=25）3.荧光稳定性考察取等量的维生素B1、B2和B6标准混合液于一系列10ml容量瓶中，按照实验方法处理，其中改变硫色素反应时间，将反应时间与相应的荧光强度作图（图4），考察反应时间与维生素B荧光强度的影响。 图4 硫色素反应