实验2和3 20131014.pptVIP

实验二、紫外分光光度计的性能检查 实验三、荧光法测定硫酸奎尼丁含量 实验安排 分2组，本周16人做紫外分析(洗玻板，2块/1人)，每4人1台紫外分光光度仪；其他同学做荧光分析，下周交换。 紫外分光光度计的性能检查见补充讲义——中国药典要求 实验目的 掌握紫外分光光度仪的性能测试内容及测定方法 （中国药典方法）； 熟悉紫外分光光度仪的操作方法； 了解紫外分光光度仪的构造原理。 仪器 北京普析1901 北京普析1810 日本日立3010 日本分光V550 实验二、分光光度计的性能检查 中国药典对紫外仪的校正和检定： 波长精度（氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正） 吸收度的准确度——用重铬酸钾的硫酸溶液检定 ? 杂散光检查 ——指一些不在谱带范围内且与所需波长较远的光（来源于仪器的瑕疵和使用保养不善）。用碘化钠和亚硝酸钠溶液检定 ? 实验内容 吸收度的准确度：取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg(实际60.8mg)，精密称定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000mL，在规定的波长处测定（先进行扫描得到波峰和波谷的波长），计算其吸收系数，并与规定的吸收系数（E 1%）比较，应符合表中的规定。 波长/nm 235/最小 257/最大 313/最小 350/最大 规定值 许可范围 124.5 123.0～126.0 144.0 142.8～146.2 48.6 47.0～50.3 106.6 105.5～108.5 杂散光的检查： 按下表配制一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定T%，应符合规定。 试 剂 浓 度/%（g/mL） 测定用波长 /nm 透光率 /% 碘化钠 1.00 220 0.8 亚硝酸钠 5.00 340 0.8 扇面镜 光源 光电倍增管 或光电池 单光束 光源 参比池 样品池 光电倍增管 或光电池 双光束 单色光 单色光 特点：有两个单色器，利用吸光度差值定量，消除干扰和吸收池不匹配引起的误差。 双波长 光源 单色器2 单色器1 ⊿A ?测 ?参 斩光器 ?1 ?2 注意事项 石英比色皿，取用时应拿取毛面，外壁用擦镜纸轻轻擦拭，不能用硬的滤纸擦，溶液装2/3高度即可，用后及时冲洗，内壁若挂水，用洗液浸泡去污。 吸光度测定时应先用空白溶剂校零，扫描时应先用空白溶剂进行基线校正。 光面 光源 实验目的 掌握荧光物质的激发光谱与发射光谱的概念与测定方法； 掌握用校正曲线法进行荧光定量分析； 熟悉荧光分光光度仪的使用方法。 仪器 日本分光FP-6500荧光分光光度仪 实验三、荧光法测定硫酸奎尼丁含量 记录仪 光源 激发单色器 样 品 池 发射单色器 检测器 放大器 吸 光 物 质 荧光分光光度计结构示意图 扫描200-400nm 激发光谱 扫描300-600nm 发射光谱 Ex Em Ex 激发光谱和荧光光谱的特征与测定方法，?ex和?em的意义与确定方法。 荧光强度 激发光波长?ex 激发光谱 荧光强度 发射光波长?em 荧光光谱 荧光测定适合于稀溶液的测定，若溶液浓度过大将产生荧光淬灭，导致荧光读数与浓度不成比例。 标准曲线：精密称取对照品13.0mg →100.0ml，精密吸取10ml→500.0ml (2.6 μg/ml)（已做） 精密吸取(2.6 μg/ml)标准液1，3，5ml，分别置25ml容量瓶中，用0.05mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀。作为对照液（测定时从低浓度开始至高浓度）。 供试液配制：精密称取硫酸奎尼丁80.0mg→100.0ml，精密吸取10ml→500.0ml (16.0 μg/ml)（理论值，已做） 精密吸取16.0 μg/ml样品液1ml，置50ml量瓶中，加0.05mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试液。 先进行荧光扫描，确定?ex和?em。 激发光谱：固定荧光波长430nm，扫描250-400nm，获得?ex≈350nm(实测值) 发射光谱：固定激发波长(实测值) ，扫描400-600nm，获得?em≈449nm(实测值) 荧光测定：在实测?ex和?em条件下测定空白、标准曲线（低→高浓度）、样品（荧光杯必须洗净）。 每个测定溶液读数3次。 根据读数和标准液浓度绘制标准曲线 计算样品液浓度C样，然后计算硫酸奎尼丁百分含量： %= ×100%。 注意事项： 容量仪器的准确操作； 荧光比色皿的拿取、使用、洗涤注意点；