质粒载体连接反应-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.9.268 质粒载体连接反应 （一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应 外源 ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５磷酸和相 邻的 3羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带 5磷酸，可生成 ４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成 ２个新的磷酸 二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感 受态细胞后可被修复。相邻的 ５磷酸和 ３羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由 两种不同的 ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和 Ｔ４噬菌 体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的 用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速 度完全由互相匹配的 ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子 （分 子内连接）还是位于不同分子 （分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情 况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生