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1.选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应 2.水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。 3.酒精脱色是革兰染色的关键，要掌握好脱色的时间。 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌； 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。 革兰染色的注意事项 显微镜使用中的注意事项 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 3.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布。 五、革兰染色结果报告： 绘图： ①镜下颜色，形状，排列方式； ②标注染色方法，放大倍数，标本号。 文字说明： 镜下可观察到：①有染成紫色的革兰阳性菌，球菌，呈单个、成双、短链或葡萄串状排列；②有染成紫色的革兰阳性菌，大杆菌，两端钝圆，芽胞位于菌体中心或次极端，呈散在或链状排列；③有染成红色的革兰阴性菌，短小杆菌，呈散在排列。 （双色笔） 革兰氏染色，×1000（目镜× 物镜），01 革兰染色 试剂 A B C D 卫生微生物检测的基本技术 苏春丽 一 、实验目的 1、掌握无菌操作、平板制备、接种、革兰氏染色及镜检技术。 2、熟悉革兰氏染色的原理。 3、了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验仪器与材料 大肠杆菌、芽胞杆菌 革兰氏染色液 载玻片 显微镜等 三、实验内容 1、无菌技术 火焰周围10厘米 液体培养基接种：接种环退出前，靠几下管壁，抖掉接种环上的菌液。接种环从后往前烧。 半固体培养基：穿刺接种 接种针 中间垂直 接近管底，但是不能刺穿 0.5-1cm 0.2-0.7% 2、接种 固体培养基：平板划线接种，斜面划线接种 从斜面底部向上划一条直线。，再从底部向上Z形来回密集划线，不能划破。 染色标本制备 3、革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是： 1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：95%乙醇脱色 4、复染：番红复染 实验原理： 细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。 当用脱色剂处理时， 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 步骤1：涂片 用接种环滴加1-2环或滴一小滴生理盐水，挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，菌膜直径在0.5~1cm。 火烤，酒精棉球 如果水多了，菌挑多了， 接种环灭菌从后往前 步骤2：干燥 涂好的菌膜在室温下自然干燥。也可在酒精灯上方稍微加热（10cm ），但不能紧靠火焰。 步骤3: 固定 手持载玻片的一端，菌膜面向上，在火焰最热部分迅速通过2-3次，待玻片冷却后方可染色。 结晶紫染色 1min 水洗，用滤纸吸干。 刚好覆盖为宜 水洗时，不要直接冲菌膜面，而应使水 从载玻片的一端流下，水流不宜过 急，以免涂片薄膜脱落。 步骤4: 染色 碘液媒染 1min，水洗，滤纸吸干。 95%酒精脱色 20-30s，水洗，滤纸吸干。 滴加：轻轻摇动，一般30s 流加：流出的乙醇无紫色。 番红复染 1-2min，水洗，滤纸吸干。 染色结果 步骤5: 镜检 干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准。 滴加香柏油。转动转换器时，不要用手指扳动物镜镜头。 从侧面注视，上升载物台，使油镜前端浸入香柏油中并几乎与标本相接。 旋动粗调节器，使载物台徐徐下降，直至出现物象，再用细调节器调至物像清晰为止。（反方向） 注意：方向 如果油镜已经离开油面，则必须重新从侧面注视，再将油