慢病毒载体介导的人乳腺癌SKBR-3细胞HER2基因沉默的实验及显像研究Experimental and imaging study of HER2 gene silencing in human breast cancer SKBR-3 cells mediated by lentivirus vector.pdfVIP

SKBR-3 HER2 20143 慢病毒载体介导的人乳腺癌 SKBR-3 细胞 HER2 基因沉默的实验及显像研究 中文摘要 慢病毒载体介导的人乳腺癌 SKBR-3 细胞 HER2 基因 沉默的实验及显像研究 中文摘要 目 的：研究特异性HER2-shRNA慢病毒载体体外感染乳腺癌细胞SKBR-3后人 表皮生长因子受体2 （HER2 ）基因的沉默对肿瘤细胞生物学行为的影响，并通过体内 移植瘤实验研究靶向沉默HER2基因后对肿瘤的基因治疗作用以及SPECT显像活体评 价RNA干扰（RNA interference ，RNAi ）效能的可行性，初步探索SPECT分子影像技 术在基因治疗领域的应用前景。 方 法：①利用本实验室保存的有效HER2-短发夹状（sh ）RNA （HER2-short hairpin RNA ，HER2-shRNA ）慢病毒表达载体和一条随机序列阴性对照慢病毒载体 感染乳腺癌SKBR-3细胞株，通过嘌呤霉素筛选建立稳定表达HER2-小干扰（si ）RNA （HER2-small interfering RNA ，HER2-siRNA ）的SKBR-3细胞株及阴性对照细胞株， 组成KD组和NC组，并将未感染的SKBR-3细胞作为CON组。②通过Real time PCR 、 流式细胞仪及Western blot检测各组细胞HER2 mRNA及蛋白的表达，流式细胞仪、 MTT法、Transwell细胞侵袭实验及划痕实验分别检测各组细胞的凋亡、增殖、侵袭及 迁移能力。③将各实验组细胞接种于裸鼠，建立荷人乳腺癌裸鼠模型实验（KD ）组 和阴性对照（NC ）组，并以未感染的SKBR-3细胞株裸鼠模型作为空白对照（CON ） 组，观察各组移植瘤的生长状况，监测瘤体大小，免疫组织化学法测定各实验组离体 131 移植瘤HER2蛋白的表达情况。④通过 I-曲妥珠单克隆抗体（Herceptin ）对乳腺癌 裸鼠进行SPECT放射免疫显像，追踪观察肿瘤显影情况，比较各实验组T/B （肿瘤/ 本底）比值。 结 果：①经嘌呤霉素筛选获得稳定表达有效干扰序列和阴性对照序列的实验 细胞株，经流式细胞仪检测，NC组和KD组的荧光表达率均大于80%。② Real time PCR 检测结果显示CON、NC 、KD组细胞HER2 mRNA 的相对含量（HER2/ β-actin ）分别 为1.000、1.081、0.326，KD组与CON和NC组相比，差异有统计学意义（P ＜0.01 ）， I 中文摘要 慢病毒载体介导的人乳腺癌 SKBR-3 细胞 HER2 基因沉默的实验及显像研究 KD组的HER2 mRNA抑制率为67.4% ；此外，应用流式细胞仪测得CON组、NC组和 KD组HER2蛋白的表达率分别为（92.40 ±2.01 ）% 、（92.97 ±2.44 ）% 、和（55.13 ± 1.65）%，KD组明显低于NC和CON组，差异有显著性（P ＜0.01 ），其HER2蛋白的抑 制率为（40.58 ±0.96 ）%；Western blot结果显示CON组和NC组HER2蛋白的相对表达 量分别为（0.5481 ±0.0102 ）和（0.5494 ±0.0135 ），而KD组明显下降，仅为（0.2784 ±0.0099 ），差异有统计学意义（P ＜0