生物竞赛辅导第十一章生物学实验（上）.doc

第十一讲 生物学实验 一．有关实验的基本技术和方法 生物学是一门以实验为基础的自然学科，几乎所有的生物学规律都源于生物学实验。在中学生生物学奥林匹克各级（国际级、国家级、省级）竞赛中，实验考试占有相当重要的地位，一般而言，理论部分和实验部分的比例大致为1︰1，而且选手们往往在实验考试中能拉大差距。因此，具有较强的操作技能、实验数据处理和实验设计能力是一个奥赛选手必备的素质。 （一）基本技术 1．显微镜基本实验技术 （1）显微镜的主要性能 ①分辨力：也称分辨本领，是指区分两个物点之间的最小距离的能力。能把两点分辨开的最小距离叫分辨距离。分辨距离越小，则分辨力越高；相反则低，所以，分辨力以分辨距离来表示。一般肉眼的分辨距离为0.25mm左右，所以比这个距离小的两点会被误看成一点。显微镜也有它的分辨距离和分辨力，这是显微镜性能中最重要的指标，它主要由物镜性能所决定。显微镜的分辨距离跟照明光的波长和物镜镜口率有关，可以用如下公式表示： 分辨距离（R）＝0.61λ/ N·A λ：照明光波长 N·A：物镜镜口率 从上式可见：照明光波越短，物镜镜口率越大，分辨力越高。一般可见光的彼长范围为400～700nm，若使用镜口率为1.25油镜，用可见光中最短波长的紫色光，则分辨距离约为0.2μm，这是一般光学显微镜分辨力极限。用高速电子束（其波长短到0.005nm）作为电子显微镜照明，分辨力可达0.2nm左右。比光学显微镜分辨力提高1000倍。 ②镜像亮度：镜像亮度与物镜镜口率平方成正比，与总放大倍数成反比，即镜口率越大，镜像亮度越大；总放大倍数越高，镜像亮度越小。所以，总放大倍敢相同情况下，要使镜像亮度增加，就应使用镜口率的物镜与低倍目镜配合。例如：总放大倍数都是200倍，则用镜口率为0.65的40×物镜与5×目镜配合，其镜像亮度比使用镜口率为0.25的10×物镜与20 ×目镜的镜像亮度高6.75倍。因目镜放大倍数过大，得到的放大虚像很不清晰。 ③视野宽度：目镇光柱所围绕的圆即视野宽度，视野宽度越大，观察标本的面积越大，则显微镜放大倍数越小。所以，视野宽度与放大率成反比。因此，当将低借物镜转换成高倍物镜时，必须先把标本移到视野正中央。否则玻片标本的影像会落到缩小视野的外面。 ④清晰度：清晰度是指显微镜能形成明显物像的能力，影响物像清晰度的主要是物镜，由于照明光的光谱不同，造成色差和透镜本身球面像差。放大倍数越高，像差越大，像就越模糊。 （2）高倍镜的使用 ①选好目标：由于高倍物镜只能把低倍镜视野中心的一小部分放大，因此，使用高倍镜前，应先在低倍镜中找到需要观察的部分，并移到视野的中央，再换高倍镜，并使之合轴，即使其与镜筒成一直线（因高倍镜工作距离短，操作时要特别小心，以防镜头砸破玻片而损坏）。 ②调正焦点：在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中可见到模糊的物像，只要略微调节细准焦螺旋，就可获得最清晰的物像。 如果高倍物镜不是原装的，常会出现下述两种情况：高倍镜碰到玻片标本，或高倍物镜离玻片标本较远，这时则需重新用高倍镜调焦，调焦方法与低倍镜相同。 换用高倍镜观察时，视野变小变暗，需重新调节视野亮度。可升高聚光器或放大虹彩光圈。 （3）油镜的使用 ①先用低倍镜找到所要观察的物体，再换至高倍镜下，将物体置于视野的中央，并使聚光器所收集的光达到最大亮度。 ②将镜筒向上旋，并且将香柏油滴一小滴于盖玻片上，油滴不可太大，以免损坏标本和镜头。 ③将油镜缓缓放下，使油镜头浸入油液，靠近观察物。然后边观察边用细准焦螺旋，由下向上调节，找到物像，此时需十分小心，否则，会将玻片压碎或使镜头损坏。 观察完毕后，重新将镜筒向上旋，并先用擦镜纸擦拭掉镜头上的香柏油，再用棉球或擦镜纸蘸少许清洁剂（二甲苯或乙醚：无水酒精＝7︰3配制的混合液）将镜头残留的油迹擦去，清洁液不可太多，否则会渗入镜头，使镜头受损。 2．简单的染色技术 （1）木质化细胞壁的染色方法 ①番红染色法 番红是一种碱性染料，可使木质化、栓质化和角质化的细胞壁及细胞核中的染色质和染色体染成红色，在植物组织制片中常与固绿配合进行对染，是最常用的染色剂之一，常用配方有下列两种： 番红水液：取0.1g番红，溶于100ml蒸馏水中，过滤后备用。 番红酒精液：取0.5g或1g番红，溶于100ml50%酒精中，过滤后备用。 ②间苯三酚染色法 将切片材料置于载玻片上，用一滴间苯三酚（5%水溶液），再加一滴盐酸，几秒钟后用吸水纸吸去多余的染料，可见材料中有红色出现，然后加一滴水，盖上盖玻片便可镜检观察（如有条件最好用甘油封片，因加水后观察时间过长容易脱色）。由于用间苯三酚染色分色清楚，木质化细胞壁被染成红色，其余部分均不着色，常用于观察根、茎、叶等营养器官。但此法不能制成永久切片，因为时间稍久易褪色。 （2）