《动物寄生虫病学》许金俊-实验十一 动物寄生虫病的免疫学诊断.docVIP

实验十一 动物寄生虫病的免疫学诊断 一、实验目的和要求 以家畜锥虫病琼脂扩散试验弓形虫病间接血凝试验锥虫病琼脂扩散试验抗原伊氏锥虫抗原或伊氏锥虫的补体结合反应抗原的原液。标准阴性和阳性血清用生物制品厂生产的标准锥虫阴性和阳性血清。被检血清使用前不必灭活和稀释。琼脂凝胶平板的制备取精制琼脂粉1.2g，氯化钠0.9g，蒸馏水100ml，1硫柳汞1ml（0.01g）及l甲基橙液4～15滴，放入三角烧瓶内，沸水中加热溶化后即成为1.2％的生理盐水琼脂凝胶。把放凉到50～60℃的凝胶小心地倒在平皿内，使成约5mm厚的琼脂层即为凝胶平板。制凝胶平板时尽量一次倒成，使表面平整，厚薄均匀。待琼脂层凝固后，以直径5～8mm的打孔器在琼脂平板上打孔，使*状分布，周孔距中央孔5～6mm。打孔后，用尖头摄子或解剖针挑出孔中的琼脂块。将平板在酒精灯上不停转动，适当加热，使底部凝胶溶化，封闭孔底即成。暂时不用的平板，保存于普通冰箱中半年有效。移液弓形虫病间接血凝试验抗原弓形虫间接血凝试验冻干抗原兰州兽医研究所生产。用于检测人和动物血清或滤纸干血滴中的弓形虫抗体，效价不低于l:1024。用前按标定毫升数用灭菌蒸馏水稀释摇匀，1500～2O00r／分离心5～10min，弃去上清液，加等量稀释液摇匀，置4℃左右24h后使用。稀释后称诊断液，4℃左右保存,1O天内效价不变。标准阳性和阴性血清兰州兽医研究所生产。被检血清受检血清，测定前56℃灭能30min。96孔 V型聚苯乙烯微量血凝反应板。稀释液配制先配含 0.l迭氮钠的pH7.2、0.15molL磷酸盐缓冲液（PBS）：磷酸氢二钠19.34g，磷酸二氢钾2.86g，氯化钠4.25g，迭氮钠 1.00g，双蒸水或无离子水加至1000ml，溶解后过滤分装，10磅15min高压灭菌。配稀释液：取含0.l迭氮钠的PBS 98ml， 56℃灭能30min的健康兔血清2ml，混合，无菌分装，4℃保存备用。移液锥虫病琼脂扩散试验将平板上各孔编号。用移液吸取抗原注入中央孔内然后向周围四孔分别加入待检血清留下二孔分别加标准阳性和阴性血清。各孔滴加量以加满但不溢出为宜。将平板放在室温下（22℃以上）或25～30℃恒温箱中，24h后检查，在抗原孔与检血清孔之间出现白色沉淀线者为阳性反应，无沉淀线者为阴性反应。弓形虫病间接血凝试验加稀释液在96孔V型反应板上，用移液器每孔加稀释液0.075ml。定性检查时，每个样品加4孔，定量加8孔。每块板上不论检几个样品，均应设阳、阴性血清对照。对照均加8孔。加样品血清、阳、阴性对照血清，第一孔加相应血清0.025ml。稀释定性检查时稀释至第3孔，定量检查与对照均稀释至第7孔。定性的第4孔、定量和对照的第8孔为稀释液对照；按常规用移液器稀释后，取0.025ml移入相应的第二孔内，如法依次往下稀释，至应稀释的最后一孔，稀释后弃去0.025ml。每个孔内的液体仍为0.075ml。各孔的稀释度分别如下表：孔号1 2 3 4 5 6 7 8 稀释度（1：） 416 64 256 1024 4096 16384 稀释加诊断液将诊断液摇匀，每孔加 0.025ml，加完后将反应板置微型振荡器上振荡 l～2min，直至诊断液中的血球分均匀。取下反应板，盖上一块玻璃片或干净纸，以防落入灰，置22～37℃下2～3h后观察结果。判定在阳性对照血清滴度不低于1:1024（第5孔），阴性对照血清除第1孔允许存在前滞现象（十）外，其余各孔均为（一），稀释液对照为（一）的前提下，对被检血清进行判定，否则应检查操作是否有误；反应板、移液器等是否洗涤干净；以及稀释液、诊断液、对照血清是否有效。判定标准＋＋＋＋）：100％红细胞在孔底呈均质的膜样凝集，边缘整齐、致密。因动力关系，膜样凝集的红细胞有的出现下滑现象。（＋＋＋）：75％的红细胞在孔底呈模样凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成很小的圆点。（＋＋）：50％的红细胞在孔底呈稀疏的凝集，不凝集红细胞在孔底中央集中成较大圆点。（十）：25％的红细胞在孔底凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成大的圆点。（一）：所有的红细胞均不凝集，并集中于孔底中央呈规则的最大的圆点。以被检血清抗体滴度达到或超过1：64判为阳性，判（++）为阳性终点。