荧光定量相关.ppt

Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 ( C-代表Cycle，t-代表threshold） Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR检测方法 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan探针为一寡核苷酸， 5’端标记一个报告荧光基团(Reporter)， 3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher)。 Cycling probe为一寡核苷酸，5’端标记一个荧光报告基团(Reporter)，3’端标记一个荧光淬灭基团(Quencher)，寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。 SYBR Green I法vs Probe法 SYBR Green I 法 ◆优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。 ◆缺点：引物要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重PCR。 Probe法 ◆优点：特异性强，能进行多重PCR。 ◆缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。 使用SYBR Green I 进行检测的问题点 * Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 检测方法 Real Time PCR 检测系统 差异显示结果验证 定性分析 绝对定量 相对定量 病毒和病原菌检测 基因芯片结果验证 siRNA效果确认 mRNA表达量分析 Real Time PCR 用途 操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率， 适用于大量样品检测，检测灵敏度高； 可以在宽广范围内进行准确定量。 生物品种鉴定 病毒和病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测 SNP解析 激发光 发射光 Ct值 Real Time PCR 原理 使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。 Real Time PCR 同一个样品重复96次PCR的扩增曲线 Real Time PCR 原理 Ct值 Ct值概念 阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上 设定的荧光检出界限。 Real Time PCR 原理 在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程，最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。 Real Time PCR 原理 Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 检测方法 Real Time PCR 检测系统 荧光染料嵌合法(SYBR Green I) 荧光探针法 TaqMan probe Cycling probe Molecular Beacon probe Hybridization probe Scorpions probe Amplifluor probe 荧光染料嵌合法(SYBR Green I) SYBR Green I 荧光染料嵌合法(SYBR Green I)作用机理示意图 热变性 引物退火 延伸反应 TaqMan Probe法作用机理 TaqMan Probe 法作用机理示意图 热变性 引物和探针与模板退火 延伸反应 探针 报告基团 淬灭基团 探针 DNA聚合酶 引物 R R R R Q R 核糖核苷酸 Cycling Probe法 热变性 酶切 延伸 Cycling Probe法基本原理 退火 以前对PCR引物的选择、PCR试剂的优化 经验不足，Probe法较为广用。 但是??? ●SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反 应体系中有非特异性扩增，非特异性DNA也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。 ●Primer Dimer的产生 二条引物的3’端具有互补序列时，引物自身也会进行扩增， 产生短链DNA片段（Primer Dimer）。 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ GATCCTAG GATCCTAG * * *