免疫组化090520.ppt

细胞生物学研究方法与技术 北京大学医学部 细胞生物学系 刘羿男 免疫细胞化学技术 一、免疫细胞化学技术的概述 二、组织和细胞标本的制备 三、免疫组化常用的染色方法 一、免疫细胞化学技术的概述 免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)又称为免疫组化(Immunohistochemistry，IHC) 是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。 一、免疫细胞化学技术的概述 (一)对抗体的要求 (二)免疫组化实验中常用的抗体 (三)抗原和抗体的结合原则 (一) 对抗体的要求 对抗体的要求：特异性高和亲和力强 Santa Cruz Sigma Upstate Cell signaling BD (主要是直标抗体) FITC或TRITC标记的二抗：北京中杉生物技术公司。 (二)免疫组化实验中常用的抗体 单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。 特异性强、抗体产量高。 多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性低，会产生抗体的交叉反应。 多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。 (三)抗原和抗体的结合原则 抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，都不能聚合成大颗粒。 免疫细胞化学技术 一、免疫细胞化学技术的概述 二、组织和细胞标本的制备 三、免疫组化常用的染色方法 四、多克隆抗体的制备方法 二、组织和细胞标本的制备 标本制备恰当，是免疫细胞化学成功的首要条件。 免疫组化对组织和细胞标本的要求： 保持所检标本原有的结构、形态； 在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不流失也不弥散，更不被隐蔽。 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。 免疫组化中常用的组织和细胞标本 一、 组织标本 (一) 石蜡切片 (二) 冰冻切片 二、 细胞标本 (三) 组织印片 (四) 细胞培养片(细胞爬片) (五) 细胞涂片 一、组织标本 (一) 石蜡切片 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法 最大优点是组织形态保存完好，且能作连续切片，有利于各种染色观察； 石蜡块还能长期存档，可供回顾性研究。 石蜡切片的制作过程对组织内抗原的显现有一定影响，但可通过某些措施予以改善。 一、组织标本 取材的特殊要求及注意事项 固定及常用的固定液 抗原修复 原因 方法 载玻片的处理 1.取材的特殊要求及注意事项 标本新鲜：一般在2h之内。超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。 取材部位：除取病灶部位外，还应取病灶与正常组织的交界处，以形成自身对照。 尽可能避开坏死区：细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察的结果。 避免挤压：组织受挤压可使边缘部位细胞形态改变并加深非特异着色。 一、组织标本 取材的特殊要求及注意事项 固定及常用的固定液 抗原修复 原因 方法 载玻片的处理 2.固定及常用的固定液 取材后的组织需立刻投于固定剂中 固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态； 具有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。 2.固定及常用的固定液 常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。 (1) 醛类 (常用多聚甲醛、戊二醛) (2) 醇类 (常用乙醇) (3) 其它 (丙酮) (1)醛类 甲醛(福尔马林)应用最广 原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。 优点： 形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露，可造成假阴性的染色结果。 (1)醛类 注意事项： 缩短固定时间，降低固定温度(4?C)；组织块不宜过厚。 改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。 固定后充分水洗以减少分子间交联。 切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。 (1)醛类 戊二醛： 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其它固定剂联合用作免疫电镜固定液。 多聚甲醛(常用4%)： 可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。 (2)醇类 最常用的醇类固定剂是乙醇 其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。 优点：穿透性强、抗原性保存好。