有机法提取DNA的原理.docx

DNA 提取中各种实验试剂作用原理 1、STE是Tris-Hcl、EDTA、Nacl的混合液。其总体作用是为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。Tris.HCl提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。EDTA：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。NaCl，有利于DNA的溶解。2、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate）使DNA与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，3、苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。Tris酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。4、氯仿的作用克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。6、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。8、STE是Tris-Hcl、EDTA、Nacl的混合液。其总体作用是为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。Tris.HCl提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。EDTA：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。NaCl，有利于DNA的溶解。9、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate）使DNA与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，10、苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。Tris酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。11、氯仿的作用克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。12、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。Tris中文品名:三羟甲基氨基甲烷;氨基丁三醇;缓血酸胺Tris结构式英文品名:Tris;Tris(Hydroxymethyl)aminomethane英文别名:2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediolTHAM;Trisbase;Trometamol通用CAS: