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病毒包装相关知识汇总应用领域随着分子生物学的理论及技术方法(特别是重组DNA技术)的迅速发展，人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因，使疾病深入至分子水平研究，于是诞生了基因诊断、基因治疗技术。基因治疗从基因角度理解是对缺陷的基因进行修复增补，或将正常功能的基因置换的方法。 从治疗角度理解是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。当代基因治疗研究的热门方法是将外源DNA或RNA片段导入靶细胞或组织，研究靶基因的上调或抑制情况。例如，有些异常基因(癌基因、病毒基因)，可通过反义核酸技术引入外源片段将其抑制；有些基因本身有治疗作用，体外合成该基因导入体内使其表达丰度提高。故选择合适高效的基因导入介质系统尤为关键。而病毒载体已成为当前基因治疗载体研究的热点。病毒载体的优势：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，感染效率高；2、病毒的宿主范围广，可以感染分裂细胞和非分裂细胞；3、病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备；4、复杂的装配过程由细胞完成；5、不同的病毒载体具有不同的表达特点；6、通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高；7、病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产慢病毒包装技术背景：慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的病毒载体。具有感染谱广泛、可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，成为导入外源基因的有力工具。目前慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰等研究以及活体动物实验中。技术原理：慢病毒载体系统包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，且能提供慢病毒所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。第三代四质粒慢病毒载体系统，相较于前代慢病毒载体，安全性大大提升。其包括如下成分：a. 基因转移/表达载体；b.辅助载体。利用表达载体和辅助载体共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取上清液后纯化病毒，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。技术特点：1、直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用。2、可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。3、可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。4、无需任何转染试剂，操作简便。5、可以根据需要选择多种标记。技术应用：1、将过表达质粒 /干扰质粒转入难以转染的细胞，比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞；2、将过表达质粒 /干扰质粒转入动物组织，以期获得长期表达；3、构建稳定过表达/干扰细胞系，再用exvivo的方法导入动物体内；4、基因治疗；5、转基因动物；6、基因敲除；7、药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用；8、快速建立生产目的蛋白的细胞系，非常有前途的真核细胞表达方法。技术流程概述：1、基因合成及病毒载体构建2、转染及验证3、细胞培养及慢病毒包装4、收获病毒液及病毒纯化5、病毒滴度检测6、感染效果WB或qPCR评价慢病毒包装常用质粒图谱：腺病毒包装技术背景：腺病毒（Adenovirus，AdV）是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。虽然一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、上呼吸道或眼部上皮细胞的急性感染；但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。根据Journal of Gene Medicine的统计，截至2006年，在全球1192项基因治疗临床试验方案中，有305项(26%)使用腺病毒载体，首次超过反转录病毒，居第一位。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介导的基因治疗可以静脉注射，还可以通过口服经肠道吸收，或通过喷雾、滴注经呼吸道吸收，使得基因治疗方案易于推广应用。技术原理：腺病毒（Adenovirus）是一种无包膜的双链线性DNA病毒，基因组长约36 kb，衣壳呈规则的20面体结构。腺病毒外源基因装载容量大，且能够感染绝大多数哺乳动物细胞，包括分裂和不分裂的细胞；除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒适用于在难以转染的细胞中进行RNA干扰、过表达特定基因和in vivo实验。常用重组腺病毒系统组成：腺病毒骨架载体（携带腺病毒主要功能基因）、穿梭载体（转移外源基因表达盒到骨架载体上）。目前应用最为广泛的是AdMax腺病毒载体系统，骨架质粒和穿梭载体共转染293细胞后，在细胞内中通过Cre/loxP实现载体重组，进而产生重组