海洋细菌Shewanella sp.Kz7的寡褐藻胶裂解酶研究Study on the oligosaccharide lyase of marine bacteria Shewanella sp.Kz7.pdf

万方数据 谨以此论文献给所有支持和关心我的人 王林娜 万方数据 万方数据 万方数据 海洋细菌Shewanella sp. Kz7的寡褐藻胶裂解酶研究 摘要 褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)通过α 或β-1，4 糖苷 键连接而成的线性多糖，褐藻胶包含三种不同的多糖片段：由β-D-甘露糖醛酸 组成的多聚甘露糖醛酸片段，即polyM ；由α-L-古罗糖醛酸组成的多聚古罗糖 醛酸片段，即polyG ；由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸随机排列组成的MG 交替片段。褐藻胶是褐藻细胞壁中含量最丰富的多糖类物质，广泛应用在医药、 食品、工业等领域。 褐藻胶裂解酶通过β-消除机制降解褐藻胶，在C4 和C5 之间形成不饱和双 键产生非还原端不饱和的褐藻胶寡糖。褐藻胶裂解酶归属于PL-5, 6, 7, 14, 15, 17,18 家族。根据降解方式的不同褐藻胶裂解酶可以分为内切酶和外切酶。内切 酶是以内切的方式将大分子褐藻胶降解为褐藻胶寡糖。而发挥外切作用的寡褐 藻胶裂解酶将褐藻胶寡糖进一步降解为单糖，单糖在非酶催化作用下转化进入 细菌 ED 途径，从而被细菌所利用。目前报道的一百多个褐藻胶裂解酶绝大部 分为内切酶，而发挥外切作用的寡褐藻胶裂解酶仅有五个，分别归属于多糖裂 解酶（PL ）7、15、17 家族。 本文通过富集培养等方法对海洋细菌进行筛选，得到了能够降解褐藻胶的 海洋细菌 100 余株。其中有三株细菌能够产生胞外的寡褐藻胶裂解酶，本文以 活性最高的菌株Kz7 作为出发菌株进行了后续研究。通过对菌株Kz7 进行 16S rDNA 种属鉴定和进化树构建，将该菌株归属于Shewanella ，并命名为Shewanella sp. Kz7 。 从海洋细菌Shewanella sp. Kz7 中克隆得到了2 个寡褐藻胶裂解酶OalS6 和 OalS17 的产酶基因，生物信息学分析发现，OalS6 归属于PL-6 家族，是该家族 报道的第一个寡褐藻胶裂解酶。其一级序列与已经报道的寡褐藻胶裂解酶序列 同源性均低于10%，并且三维结构模拟发现，该酶的三维立体结构与其他的寡 万方数据 褐藻胶裂解酶均不相同。OalS17 归属于PL-17 家族，与其氨基酸序列相似度最 高仅为49% 。其三维结构与其他的PL-17 家族寡褐藻胶裂解酶类似。 分别对OalS6 和OalS17 进行了异源重组表达。并对重组酶进行分离纯化和 酶学性质研究。其中OalS6 是一个PolyG 特异性的寡褐藻胶裂解酶，以外切的 方式降解褐藻胶和褐藻胶寡糖为单糖。该酶最适反应温度为 40 °C，最适反应 pH 为7.3 。在40 °C 以下和pH 为6.2-8.2 之间酶活力保持稳定。NaCl 和KCl 能 + + 够显著的提高酶的活性，但是酶发挥催化作用不依赖于Na 和K 。OalS17 的最 适反应温度为50 °C，最适反应pH 为6.8 。该酶在40 °C 以下和pH 6 – 9 范围内 保持稳定。OalS17 降解方式为外切，降解终产物为褐藻胶单糖。对其底物特异 性研究发现该酶对polyM 具有较高的活性，对polyG 也具有催化活性。 对寡褐藻胶裂解酶降解产物进行结构鉴定，利用 TLC 方法制备重组酶 OalS6 的降解主产物，并用NMR 和MS 波谱学方法对产物进行了结构的鉴定。 鉴