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仪器分析;第十一章 荧光分析法;种类：分子荧光，原子荧光。(紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等)。 特点： （1）荧光光谱第一个主要优点是灵敏度高、选择性好： 由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量到的荧光频率与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用的样品量很少，检测限低10-10 ~ 10-12g/mL。 （2）荧光光谱第二个主要优点是信息量大： 荧光光谱能提供较多的信息，例如激发光谱、发射光谱、峰位、峰强度、荧光寿命等。在生化分析中的应用较广泛。 ;一、荧光分析法的基本原理 二、荧光定量分析方法 三、 荧光分光光度计;第一节 荧光分析法的基本原理;2.荧光的产生;非辐射能量传递过程;外 转 ??： 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；从S1*、 T1* 最低振动能级回到基态。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 体系间跨跃: 当电子激发单重态的最低振动能级与电子三重激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的 S1*—T1* 跃迁，这一过程称为 “体系间跨跃” 。 ;荧光发射 无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。 磷光发射 经过体系间跨越的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级，而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。;分子吸收和发射过程的能级图 ;电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级； 磷光：10-4～10s, 第一激发三重态的最低振动能级→基态各振动能级；;（二）荧光的激发光谱和发射光谱;硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱 ;荧光光谱的特点：;仪器分析;二、荧光与分子结构;荧光寿命：除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间. 利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光物质混合物的分析。 荧光效率：荧光量子产率 发荧光的分子数目与基态分子吸收激发光的光子数的比值即 荧光效率 ;(二)荧光与分子结构的关系 1.碳原子骨架----具有共轭双键体系的分子。能够吸收紫外可见光，易发生π→π*或n→π*跃迁， π电子的共轭程度越大，越易被激发而产生荧光，荧光强度越大，荧光波长也长移。 ; 2. 分子的几何排布--分子的刚性平面结构有利于荧光的产生。 刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用， 故具有很强的荧光。 如荧光素和酚酞有 相似结构，荧光素 有很强的荧光，酚 酞却没有。 ;（三）荧光试剂 提高灵敏度和选择性 荧光胺－与脂肪族、芳香族伯胺形成衍生物275nm、390nm，480nm 邻苯二甲醛－伯胺340nm，455nm 丹酰氯－伯仲胺及酚基的生物碱 无机离子－有机物 形成配合物 －－荧光 （还有一些干扰物荧光减弱或熄灭） ;Fura-2是一种荧光指示剂可与胞内的游离钙离子特异结合，其游离（未结合）形式的Fura-2比与钙结合形式的Fura-2在更长的波长上被激发， 即：结合形式的Fura-2激发波长为340nm，游离形式的Fura-2激发波长为380nm。 因此通过检测两个激发波长上荧光强度的比率，就可以确定 结合钙的Fura-2与未结合的Fura-2的比例，进而可求游离Ca 2+的浓度。 ;三、影响荧光强度的外部因素;（3）酸度：荧光光谱和荧光效率常与溶液的酸度有关，;（4）荧光熄灭剂 荧光淬灭：荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降、消失,或荧光强度与浓度不呈现线形关系的现象。 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。 定量：荧光强度的减弱—正比—荧光熄灭剂 （5）散射光 光子与物质分子 方向改变，波长不变－－－瑞利散射 方向改变，波长改变－－－拉曼散射 选择适当溶剂、适当的波长;第二节 荧光定量分析方法;根据朗伯-比尔定律 　　 Ia=I0-It=I0(1- e-2.303εbc) =