环境水中细菌种类分布及耐药性研究(10.6).docVIP

环境水中细菌种类分布及耐药性研究 摘要：目的 了解环境水体中细菌的种类及其耐药性。 方法 采集医疗单位周边、居民生活区及养殖场周边等环境水,分离鉴定细菌种类,采用K—B法及MIC法测定其对常用药物敏感性，采用聚合酶链式反应及序列分析的方法分析耐药基因类型。 结果 从***市环境水中共分离出细菌151株，其中弧菌科细菌79株，肠杆菌科33株，非发酵菌28株，微球菌属5株，葡萄球菌5株，链球1株。主要分离自生活区环境水中,占49.0%。弧菌科对头孢唑林耐药率为46.15%，肠杆菌科对四环素、头孢唑林耐药均为24.24%，非发酵菌对氨曲南耐药为35.71%。ESBLs表型确证试验筛选产ESBLs的四株肠杆菌其染色体及质粒上携带TEM、SHV、CTX-M型耐药基因，未检出CTX-M1，CTX-M2，CTX-M8及VEB基因。非发酵菌耐药组OXA-24基因携带率为10.00%(1/10),OXA-51基因携带率为20.00%(2/10),SHV基因携带率为20.00%(2/10),未检测到TEM、OXA-23、OXA-58基因。庆大霉素耐药的菌株55.6%(10/18)携带有ant(3’’)-I基因，44.4%(8/18)携带有aac(6’)-I基因，27.8%(5/18)携带有aac(3)-I基因，未检测到aac(3’)-II基因。结论 ***市环境水中细菌种类多，携带的耐药基因型繁多，人民应当重视环境水中的生态，消灭环境水这个耐药基因库，不仅将有助于控制耐药问题，还有助于维持生态环境的稳定，提高人类的健康水平。 关键词：环境水；耐药性；细菌种类及分布；超广谱β内酰胺酶 环境水体中细菌种类繁多，与人类生活密切相关，不仅水中的微生物可来源于人类的各种活动，人也可因多种活动而接触水中的微生物甚至感染，如经口进入人体，引起腹泻、食物中毒等肠道感染性疾病；经破损皮肤黏膜侵入，引起伤口感染等[1]。另外沙门菌、志贺菌及霍乱弧菌都可经由水传播，引起传染病的暴发流行。但自1942年Ramel-kamp和Maxon首次报道对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌以来，人们开始认识到并逐步重视细菌的耐药性。耐药菌的出现增加了感染性疾病治愈的难度，其治疗成为世界性关注的问题，对其耐药情况分析具有重要意义。本实验调查研究环境水中细菌耐药情况及耐药基因携带情况，并对耐药不动杆菌属进行同源性分析，了解菌株耐药性的演变和耐药基因分布，为从源头解决细菌耐药问题提供可靠依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1菌株来源 收集医疗单位周边、居民生活区、畜牧或水产养殖场周边4种环境水中分离的细菌共151株，其中弧菌科细菌79株(占52.3%)，肠杆菌科33株(占21.9%)，非发酵菌28株(占18.5%)，革兰阳性球菌11株(占7.3%)，剔除同一地点重复分离株。 1.1.2试剂和仪器 Eppendorf 5417 R型台式高速冷冻离心机购自艾本德中国； CU-600型电热恒温水槽购自上海一恒科学仪器有限公司；GRP-9080型隔水式恒温培养箱购自上海森信实验仪器有限公司；LifePro基因扩增仪TC-96/G/H(b)AG购自杭州博日科技有限公司。Gel Doc XR+型凝胶成像系统购自美国伯乐公司中国。 1.2方法 1.2.1细菌分离 1ml原水样加入9mlLB液体培养基，37℃，180rpm，18~24h，四区划线接种于血琼脂培养基，37℃培养18~24小时。取出血琼脂平板，观察并记录细菌生长情况，根据菌落的形态特征（大小、形状、边缘、光泽、透明程度、表面、质地、颜色和溶血情况）分离得到不同的菌株。 1.2.2细菌鉴定 对分离得到的菌株从形态、培养特性及生化反应特征等方面进行鉴定；对于较难鉴定或生化特性不明显的分离菌，提取细菌基因组DNA，测序比对确定细菌属种。 1.2.3药敏试验 采用Kirby—Bauer纸片法和微量肉汤稀释法测定细菌对抗菌药物的敏感性，试验结果判断参照CLSI/NCCLS标准。 1.2.4细菌耐药基因检测 BLA基因检测 TEM、SHV、OXA、CTX、aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6’)-I、ant(3’)’-I 基因的PCR：各型基因PCR引物由上海桑尼测序有限公司合成。 根据GenBank (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/)中已发布的各型耐药基因序列设计引物，具体引物序列及长度见表1。 表1 PCR引物序列及产物长度 Table1 PCR primers sequences and the length of the product 基因 引物序列（5’-3’） 产物长度（bp） OXA-23 P1:GATGTGTCATAGTATTCGTCGT P2:TCACAACAACTA