细胞存活曲线的测定与结果分析.pptVIP

实验二细胞存活曲线的测定与结果分析 实验目的 了解克隆形成法建立细胞存活曲线的实验方法原理和基本操作步骤 熟悉细胞存活分数与受照剂量间的剂量-效应关系及与结果分析处理相关软件的使用方法 掌握细胞存活曲线的拟合、绘制与结果的正确分析方法 实验原理 电离辐射引起细胞死亡是评价辐射整体效应的重要基础。 在放射医学领域中将细胞死亡分为间期死亡和增殖死亡两种类型。 间期死亡（interphase death）是指受照射细胞未经细胞分裂即在间期发生死亡。 增殖死亡（reproductive death）是指受照射的细胞丧失了继续增殖的能力，在经过一个或几个有丝分裂周期后丧失代谢活动和细胞功能而死亡。 从辐射致死效应的角度，把细胞“增殖能力”的完整性作为存活与死亡的判断标准。 鉴别“细胞存活”的唯一标准：照射后细胞是否保持再繁殖的完整性，即所分析的是克隆源细胞的增殖活性而不是受照射群体中任意细胞的功能活性。 克隆形成 细胞克隆：在体外培养的单个细胞直接分裂增殖形成的细胞群体。 计数克隆形成数目时，通常把含有50以上的细胞克隆计为一个细胞集落，代表一个存活的细胞。 细胞存活曲线 细胞辐射剂量存活分数曲线（clonogenic survival fraction curve）反映了电离辐射照射剂量与细胞存活率之间的关系。 在培养皿上培养有增殖能力的细胞，观察细胞集落形成率，以每一集落代表1个存活细胞。以集落形成率代表细胞存活率与照射剂量在半对数座标纸上作图即构成细胞的剂量存活曲线。 细胞存活曲线模型 细胞存活曲线常用模型 单击多靶模型 SF= 1–(1–e-kD)N 线性平方模型 SF= e–D(α+βD) 细胞存活曲线模型的选择 单击多靶模型 1、常用于放射生物学基础研究； 2、适于评价不同组织类型，或不同因素影响下细胞电离辐射敏感性的差异，此模型中D0，n和Dq等参数可定量描述敏感性和损伤细胞的修复能力差异。 线性平方模型 90%放射肿瘤学家选择此模型，多用于临床研究。 1、此模型简单； 2、适于分割剂量1-6Gy（临床治疗常用剂量范围），分割剂量2Gy此模型对存活率估计偏高； 3、模型中参数比值α/β可反应正常或肿瘤组织的辐射反应性。 单击多靶细胞存活模型 本实验要求掌握单击多靶模型对实验数据的模拟方法：SF= 1–(1–e-kD)N；同学也可自行按线性平方模型拟合方法求出a和b值。 要求计算单击多靶模型细胞存活曲线Do、Dq和n等特征参数值。 根据D0， Dq 和n等参数，比较不同实验条件下细胞辐射敏感性的变化。 剂量存活曲线不但可反映不同细胞辐射敏感性与剂量间依赖关系，对临床放疗和放射医学基础研究也都有重要的指导意义。 特征性参数涵义 D0为平均致死剂量，理论上是使每个细胞平均被击中一次所需要的辐射剂量，数值上D0＝1/k。 Dq为准阈剂量，表征修复亚致死损伤的能力，即克服单击多靶曲线中“肩宽”所需的剂量，数值上Dq＝ln n × D0。 D37是指当细胞存活分数为37%时相应的辐射剂量，在单击多靶模型中 D37＝D0 + Dq。 k为细胞钝化常数，其值可由拟合曲线方程直接给出。 n称外推数，代表理论上的靶数目。 实验基本步骤 细胞准备与照射 取处于对数生长期人宫颈癌HeLa细胞，0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数细胞浓度。 组别设置及接种细胞数如右图所示，接种细胞于25cm2培养瓶中，每组设3个平行实验瓶。 37℃，5% CO2下正常培养4 小时待接种细胞贴壁生长。衣霉素Tun给药组贴壁后给药，放射增敏剂甘氨酸单钠GMNa照射前给药。接种细胞12小时后，将培养细胞转移至钴源室接受相应剂量伽马射线的照射处理，其中假照射组细胞不接受照射处理。 细胞培养、克隆计数与存活分数计算 将接受照射后的细胞放回细胞培养箱继续培养，每三天更换新鲜培养液一次。待培养至9天后弃去培养基，0.5%结晶紫染色，统一确定存活的克隆细胞计入标准。 计数并记录不同照射剂量下各组培养瓶中存活细胞克隆个数，计数结果如下表示。 克隆计数结果 细胞存活分数计算 根据假照射处理组细胞克隆形成数目，计算细胞接种效率（PE）； 各照射处理组细胞存活分数（SF）为各组细胞克隆形成的平均数除以相应细胞接种数与接种效率的乘积。 细胞存活分数计算结果 利用SPSS拟合获得参数k,n 通过实验获得细胞克隆数计算，得到不同剂量下各组细胞存活率，根据单击多靶细胞存活模型和SPSS软件拟合求出参数k，n值。 根据获得的参数k，n，计算不同处理组Do、Dq、 D37 等特征参数。 计算 Do、Dq、n等参数的公式： D0＝1/k ； Dq＝ln n × D0； D37＝D0 + Dq。 学生作业 根据SPSS分析结果做拟合优度检验