2.定磷法测定核酸含量的原理.pptVIP

核酸含量测定 定磷法 课前思考题 1. 核酸定量测定的方法有哪些？ 2. 定磷法测定核酸含量的原理？ 3. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果有哪些影响？ 4. 使用移液管应注意哪些细节？ 5. 本实验成败的关键是什么？ 6. 回收率的意义。 试剂 酵母RNA样品溶液：2000μg/mL 标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL 实验步骤 1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线； 3. 测定回收率和样品总磷量。 1. 样品消化（每两组或三组做一份） 2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作： 3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行） 数据处理 关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管作为空白。 以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。 操作注意事项 1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力，加入定磷试剂时应加一管混匀一管。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。 722型分光光度计的使用 1. 仪器调整： 预热：开启电源，预热30分钟。 设定波长：旋动波长旋钮，调至660nm。 置入参比溶液：将装有去离子水的比色皿置入样品室光路中。 调0%、100%T：按“模式”键，使“透射比”指示灯亮，打开样品室盖，按“0%”键，使数字显示为 “0.0”；盖下样品室盖，按“100%”键，使数字显示为100.0（一次有误差时可加按一次）。 按“模式”键，使“吸光度”指示灯亮，此时数字显示应为零。 实验结束 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。 将实验台面擦干净。 * * 50 50 50 用dH2O定容/mL 沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却 消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却 1 1 1 dH2O/mL 2 2 2 5mol/L H2SO4/mL 混匀 0 0 1 dH2O/mL 1 0 0 标准磷原液/mL 0 1 0 RNA/mL 3 2 1 消化管 0 A660平均值—空白 A660平均值 A660(2) A660(1) 用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为参比溶液，660nm测定吸光值 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 定磷试剂/mL 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 dH2O/mL 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 标准磷溶液/mL ?6 ?5 4 3 ?2 ?1 ?? 9（标准） 8（样品） 7（空白） 0 A660平均值—空白 A660平均值 A660(2) A660(1) 用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 1.5 1.5 1.5 定磷试剂/mL 1.35 0 0 dH2O/mL 0.15 1.5 1.5 定容溶液/mL 计算回收率： (2) 计算样品总磷量： (3) 计算RNA量： (4) 样品RNA含量： 空白比色皿放在试样架第一个空中，调整仪器。 第二个比色皿用于测定，拉杆拉出一格即可读数。