酶-动物疾病研究报告行动知识家-家畜卫生试验所.docVIP

水禽雷氏桿菌症３價不活化菌苗之效力試驗 喻昭芳＊緒言 由Riemerella anatipestifer（RA）引起的水禽雷氏桿菌症為台灣重要的水禽傳染性疾病，鴨和鵝在1~8週齡時對本病最具感受性，主要引起病禽敗血症、全身性漿膜炎、恢復禽隻生長遲緩及不合格屠體增加﹝9﹞，不良的飼養環境及其他疾病併發皆會造成本病的爆發，發病率可由5%~75%﹝3﹞，發病場常一再發病，且清除不易而重複發生，造成業者經濟損失﹝9﹞，故發展有效菌苗防疫為一必然趨勢。 本菌的血清型別複雜，目前共有21種血清型別﹝3、16﹞，Loh及張等人發現第5與第9型間；第12與6和16型間；第13與17型間；以及第17與第2和13型間具微弱交叉反應，其餘之間皆無交叉保護力﹝5、6、14﹞，而造成預防上的困難。最理想的方式是突破血清型別的限制，找出可產生保護力之致病或毒力因子來開發菌苗防疫﹝7﹞，目前雖有本菌相關毒力因子的報告﹝8、12、20﹞，但病原的致病機轉仍不明，國內亦缺乏快速檢測試劑與商業化疫苗﹝2﹞，所以現階段施打有效的多血清型多價菌苗，應是最佳的防治方式與暫時解決的方法。 96年本所已選定臺灣流行之第1、2和6血清型菌株研製與開發3價不活化菌苗﹝10﹞，並已製備小批菌苗於實驗室測試，結果顯示不論使用於北京鴨、番鴨亦或白羅曼鵝，其保護效果皆令人滿意。本次研究則進一步瞭解此3價菌苗大量產製後應用於田間水禽場，其菌苗對鴨及鵝隻的保護力是否與之前實驗室內小批進行的結果一致。本病在台灣水禽場與孵化場普遍污染，乾淨試驗動物取得困難，另嘗試同時免疫小白鼠與鴨隻獲得兩種動物的效力成績後進行評估，以瞭解是否可使用小白鼠模式測定取代對象動物。 材料與方法 3價不活化菌苗製備 將96年選定的台灣田間分離第1、2和6血清型RA菌苗株於37℃下培養於胰蛋白浸膏培養基（Tryptic Soy Broth, BD）18~22小時大量產製，以0.3%福馬林溶液（Formaldehyde Sol. 37%, Merck）予以不活化，離心調整至適當濃度，再加上氫氧化鋁膠（Aluminum Hydroxide Gel）調製成3價不活化菌苗﹝13﹞。 效力試驗 於第1及2週齡時在實驗室免疫北京鴨與白羅曼鵝各約45隻，另未注射各45隻供作對照，而在4週齡時使用同型（homologous）3種血清型菌株各分3階段濃度菌液（如：1010、109、108CFU/mL）每階段5隻動物分別肌肉注射攻毒免疫組及對照組，攻擊後觀察2週內兩組死亡結果，以Beherens-Karber法計算兩組LD50防禦指數（例：免疫組之LD50為1010.0，對照組為109.0，則兩組之LD50對數差為101.0）﹝1﹞，以此評估本菌苗的效力。之後應用於雲林縣和嘉義縣轄內水禽場，免疫注射各1,500隻北京鴨與番鴨，及2,000隻白羅曼鵝，屆4週齡時由免疫組與未注射組隨機取各45隻帶回所裡攻毒，同上法計算其LD50防禦指數，最終獲得3價菌苗對田間水禽場鴨和鵝隻的效力試驗成績。 小白鼠與鴨隻效力試驗一致性比較 以3價菌苗同上法免疫鴨隻，同批菌苗稀釋2~5倍腹腔注射10~15g健康小白鼠，基礎免疫及補強注射間隔1週，鴨隻達4週齡時對鴨與小白鼠攻毒，同上法觀察2週，最終得到鴨和小白鼠的LD50防禦指數，並比較菌苗對兩種動物的保護性是否一致。 小白鼠免疫後抗體消長檢測 小白鼠免疫3價菌苗後，補免後每週採血5隻，至第8週結束，取得的血清進行平板凝集試驗及ELISA試驗，檢測3種血清型血清抗體力價消長，ELISA方法詳見本所第43期研究報告，僅於二抗部份改為10萬倍稀釋HRP標示羊抗鼠抗體（Goat-Anti-Mice IgG, KPL），由血清OD值計算出S/N比（Sample / Negative Ratio）。 結果 效力試驗 本次研究結果顯示，在實驗室方面菌苗的效力試驗成績，北京鴨於免疫3價菌苗後分別攻擊3種血清型菌株的LD50防禦指數為101.66（RA1）、100.875（RA2）與100.83（RA6） ﹝表1﹞；而在鵝為101.89（RA1）、100.87（RA2）及101.5（RA6） ﹝表2﹞。另外田間試驗部份，對北京鴨與番鴨的LD50防禦指數為100.84（RA1）、101.205（RA2）與101.5（RA6）; 100.73（RA1）、101.33（RA2）和100.83（RA6） ﹝表3和表4﹞；對鵝則是104.17（RA1）、106.0（RA2）和101.47（RA6） ﹝表5﹞。 小白鼠與鴨隻效力試驗一致性比較 表6為3價菌苗同時免疫及攻毒小白鼠和鴨隻，免疫3價菌苗後的防禦指數成績為RA1：100.2（鼠）、100.78（鴨）；RA2：100.5（鼠）、101.78（鴨）；RA6：100.75（鼠）、無