Norhern blot RNA分子杂交.docx

实验材料总RNA样品或miRNA样品，探针模板DNA (探针设计时候，可以只设计部分序列匹配，而非全部匹配。。。)药品与试剂DEPC固相RNase清除剂双氧水SDS40% PAGE（聚丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺 19:1）10% APS10×TBE bufferTEMED尿素滤纸Nylon Membranes, positively charged（Cat. No.11209272001）DIG Oligonucleotide Tailing Kit, 2nd Generation (Cat. No. 03353583910)DIG Easy Hyb Granules (Cat. No. 11796895001)DIG Wash and Block Buffer Set (Cat. No. 11586762001)Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (Cat. No. 11093274910)CSPD（Cat. No. 11655884001）CDP-Star （Cat. No. 11685627001）（一）仪器设备名称生产厂家备注恒温水浴箱电泳仪BIO-RAD凝胶成像系统半干转膜仪BIO-RED紫外交联杂交箱HL2000UVP南院303化学发光成像系统GBOX-CHEMI-XT4-ESygene北院106摇床生化培养箱恒温摇床，脱色摇床，微量移液器，RNase Free离心管（50ml、15ml、1.5ml），烧杯，量筒，三角瓶，平皿、镊子、玻璃棒。?尼龙膜，滤纸。1.?用具的准备：处理DEPC水(2 L)备用。烧杯、平皿、量筒、镊子、刀片等用锡箔纸包好，180℃烘烤4-8小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染。用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。Northern blotting1.制备15%的尿素变性PAGE 胶15ml，体系如下：成分体积/质量尿素7.2g10×TBE buffer 1.5ml40%PAGE5.6ml 加DEPC水补足15ml10%APS75μlTEMED15μl2. 注胶40min后，200V预电泳30-60min。3. 15μg RNA样品与上样缓冲液混合，70℃变性15min，然后冰上静置1min。RNA Marker做同样变性处理。4. 清除上样孔中的胶碎片及析出的尿素冲洗干净，赶出凝胶底部的气泡，上样，用加样器上样，会沉淀好些。5. 250V电泳30-60min，至溴酚蓝接近底部。6. 将PAGE胶从玻璃板上小心地剥下，放在大平皿中，切去多余的部分( 上样孔和两侧)。切下Marker于EB中染色，照相（EB不能太浓，背景过亮不利于观察结果）。裁剪与胶大小相同的尼龙膜和Whatman层析滤纸, 将它们浸泡在0.5×TBE缓冲液中。按照滤纸-尼龙膜-胶-滤纸的顺序依次铺在半干转膜仪上，每铺一层要注意用玻棒在“三明治”上滚动，赶走气泡，可再添加一些0.5×TBE缓冲液使其更湿润。以恒压15V转膜1小时。取出膜后用切角方式标记RNA的一面7. UV交联：将膜取出后置于2×SSC缓冲液中浸泡过的滤纸上，使其保持湿润，2000J交联90sec。将膜储存在洁净密封袋中备用。8. 预杂交：杂交液37℃预热10min，将膜放在杂交袋中加入15ml预热的杂交液进行预杂交30-60min。9. 探针制备：不用加尾试剂盒的话，操作如下，100pM的探针5μl，加入15μL depc水，95℃变性5min，取出后马上冰上放置3min。然后加入预杂交的袋中，进行杂交过夜。按照以下体系配置反应液（20μl体系）：成分质量/体积RNA探针100pmolReaction buffer4μlCoCl2-solution4μlDIG-dUTP solution1μldATP solution1μl400U Terminal transferase1μl混匀后，于37℃反应15min，取出后冰上放置，在体系中加2μl 0.2M EDTA (ph8.0)终止反应。10. 杂交：将探针加入杂交液中进行杂交，37℃，40rpm杂交过夜。11. 洗涤、染色：1) 杂交结束后用镊子取出膜，放入装有20m1 2×SSC，0.1% SDS溶液的平皿中，室温振荡洗涤2次，每次15min。2) 用镊子将膜转入0.1×SSC，0.1% SDS溶液(先放50℃水浴预热)中，50℃水浴振荡洗涤2次，每次15min。4) 在杂交和严谨洗涤后，在Washing buffer（DIG Wash and Block Buffer Set, Cat. No. 11585762001）中浸润1-5min。